動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)知識(shí)

動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)2009-09-25石欣欣1基礎(chǔ)知識(shí)要點(diǎn)一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念二、細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件三、細(xì)胞培養(yǎng)的基本過(guò)程四、細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)施設(shè)備及培養(yǎng)器皿五、細(xì)胞傳代的準(zhǔn)備工作六、細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作七、細(xì)胞庫(kù)八、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)提高表達(dá)量需要解決的問(wèn)題

及實(shí)驗(yàn)方法九、細(xì)胞培養(yǎng)需要注意的問(wèn)題2一、基本概念1、細(xì)胞培養(yǎng)：動(dòng)植物細(xì)胞在體外條件下存活和生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織，主要是指用來(lái)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。2、動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的生長(zhǎng)類(lèi)型：貼附型和懸浮型。3、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)：是建立在貼壁培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上，融合了固定化培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、生物反應(yīng)器技術(shù)等而發(fā)展起來(lái)的。主要包括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中控纖維培養(yǎng)等。3二、基本條件1、無(wú)菌無(wú)毒的培養(yǎng)環(huán)境。2、恒定適宜的培養(yǎng)溫度。3、合適的氣體環(huán)境和pH。4、充足的營(yíng)養(yǎng)，包括多種氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌呤、嘧啶、生長(zhǎng)因子。4細(xì)胞培養(yǎng)基介紹天然培養(yǎng)基---血清無(wú)血清培養(yǎng)基---人工合成化合物，成分確定的培養(yǎng)基，例如CHO325。無(wú)蛋白培養(yǎng)基---不添加蛋白，但可能包含動(dòng)物或植物來(lái)源的成分?；瘜W(xué)限定培養(yǎng)基---不含蛋白水解物，均為已知化學(xué)結(jié)構(gòu)。5三、基本過(guò)程1、從整個(gè)操作過(guò)程來(lái)說(shuō)包括：（1）細(xì)胞小瓶培養(yǎng)---傳代操作（2）細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)---轉(zhuǎn)瓶、反應(yīng)器操作（3）細(xì)胞凍存和復(fù)蘇---原則2、從細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程來(lái)說(shuō)包括：（1）延遲期（潛伏期）---傳代初期，細(xì)胞增殖緩慢。（2）指數(shù)生長(zhǎng)期（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）---細(xì)胞快速繁殖期。（3）停滯期（平臺(tái)期）---細(xì)胞數(shù)量不變，

但仍進(jìn)行代謝活動(dòng)，進(jìn)行分泌表達(dá)。（4）衰亡期（凋亡期）---細(xì)胞自溶、死亡。6四、設(shè)施設(shè)備及培養(yǎng)器皿1、設(shè)施設(shè)備：無(wú)菌操作間、超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、滅菌柜、離心機(jī)、顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰箱、工作臺(tái)、生物反應(yīng)器、電腦等。2、培養(yǎng)器皿：培養(yǎng)瓶、搖瓶、滾瓶、轉(zhuǎn)瓶、移液管、離心管等。3、其它常用物品：酒精燈、鑷子、止血鉗、紗布、脫脂棉、膠塞等。7五、細(xì)胞傳代的準(zhǔn)備工作1、無(wú)菌操作間的清潔2、超凈工作臺(tái)的清潔3、培養(yǎng)器皿的準(zhǔn)備：洗刷包扎、滅菌4、培養(yǎng)基的配制、除菌過(guò)濾及無(wú)菌驗(yàn)證8六、細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作1、細(xì)胞凍存操作凍存細(xì)胞：1*107cells/ml*1ml/管凍存液配制：（培養(yǎng)基：血清：DMSO=7：2：1）凍存程序：4℃、30~60min-20℃、1~2h-70℃、過(guò)夜液氮中長(zhǎng)期保存。溫度降低原則：達(dá)到4度，然后達(dá)到-20度冷凍狀態(tài)，再轉(zhuǎn)移到-70度，18h后，在液氮中保持。92、細(xì)胞復(fù)蘇操作（1）登記要取用的細(xì)胞。（2）快速取出細(xì)胞放于準(zhǔn)備好的37度水浴中，快速溶解。（3）將溶解的凍存管細(xì)胞離心，根據(jù)細(xì)胞特性，選擇合適的離心強(qiáng)度。（4）酒精棉擦拭凍存管后放于超凈臺(tái)，將細(xì)胞沉淀用新鮮培養(yǎng)基重懸后置于離心管中進(jìn)行離心。洗滌步驟，去除DMSO。（5）細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基傳入培養(yǎng)瓶中。103、細(xì)胞傳代操作（1）先用酒精棉擦拭需要放入超凈臺(tái)的物品，然后將物品放入超凈臺(tái)進(jìn)行操作。（2）無(wú)菌取樣，通常檢測(cè)細(xì)胞密度、活度、葡萄糖、乳酸，根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化等還需要檢測(cè)其他各項(xiàng)生化指標(biāo)。（3）根據(jù)預(yù)先實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的傳代密度或者稀釋比例來(lái)添加新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行傳代，記錄代次。（4）在進(jìn)行方瓶、滾瓶等大瓶傳代時(shí)，需要兩名實(shí)驗(yàn)員密切配合操作，并由監(jiān)控員協(xié)助進(jìn)行物品傳遞等工作。因此熟練各環(huán)節(jié)的細(xì)節(jié)操作對(duì)于保證無(wú)菌來(lái)說(shuō)非常重要。114、生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的基本操作流程（1）反應(yīng)罐安裝、調(diào)試電極、管路連接。（2）反應(yīng)罐洗刷、滅菌。（3）檢查滅菌管路、連接電極線。（4）通過(guò)取樣口抽出罐內(nèi)滅菌水。（5）將補(bǔ)料、收料