三七總皂苷對高糖誘導糖尿病腎病大鼠gf-

三七總皂苷對高糖誘導糖尿病腎病大鼠gf-

糖尿病性胃炎（dn）是糖尿病常見和嚴重的長期并發(fā)癥之一，也是糖尿病的主要原因之一。中醫(yī)藥治療DN具有獨特的優(yōu)勢,創(chuàng)新中藥開發(fā)及其作用機制研究成為了目前的研究熱點。三七具有化瘀止血、活血定痛、補虛強壯的效,其主要活性成分為三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)。課題組前期創(chuàng)新性地研究發(fā)現(xiàn)PNS能夠改善阿霉素腎病腎纖維化,PNS單體能夠降低TGF-β1mRNA表達而延緩DN腎纖維化。根據(jù)中醫(yī)異病同治理論,不同器官纖維化雖然是相對獨立的疾病,但發(fā)病的某一階段的基本病理改變是相同的,可以采用相同的治療方法。在此基礎上,本研究進一步將PNS作用于單側(cè)腎切除后一次性腹腔注射STZ大鼠DN模型,探討PNS對DN的防治作用機制。材料和方法1.材料表面1.1實驗動物、飼料純系SD大鼠44只(購自北京維通利華動物實驗中心,合格證號:SCXR京2006-009),雄性,7周齡,體質(zhì)量220-230g。適應性喂養(yǎng)1周,自由飲水,進食普通飼料;大鼠腎小球足細胞,由美國維恩大學醫(yī)學部張玉祥教授饋贈。1.2準字點材料PNS:廣西梧州制藥(集團)股份有限公司,批準文號:國藥準字Z20025652;厄貝沙坦(IRB):購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司,批準文號:國藥準字J20030113;STZ:北京市博愛港商貿(mào)有限公司,批號:S-0130。1.3細胞培養(yǎng)和pcr檢測光學顯微鏡(Olympus,L340099);圖像分析儀(LEICAQ500IW);全自動生化分析儀(OlympusAU400);RT-PCR電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,JY-SPA);紫外/可見分光光度計(日本UY-2000型);凝膠成像系統(tǒng)(PharmaciaBiotech);細胞培養(yǎng)箱(HeraeustypeB5060EK/CO2,德國);TGF-β1一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,bs-0103R);Caspase-3一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,bs-0081R);免疫組化SABC二抗試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,SP0023);TGF-β1原位雜交試劑盒(天津灝洋,探針序列:5,-GGTGATTCTCTTGTAGTTCTCCAGCCGAC-3,);足細胞培養(yǎng)液:RPMI1640培養(yǎng)基90mL,PBS10mL,104U/mL青霉素/鏈霉素1.0mL,103U/μLγ-干擾素1.0μL,調(diào)pH值至7.2,4℃保存;胎牛血清(杭州四季青);TGF-β1因子(北京康為世紀生物科技有限公司);RT試劑盒(Fermentas公司RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit,K1622);PCR試劑盒(2×TaqMasterMix,北京康為世紀生物科技有限公司);RT-PCR引物序列:GAPDH,FW:CAAGGTCATCCATGACAACTTTG,RV:GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG,496bp;Caspase-3,FW:ATGGACAACAACGAAACCTCCGTG,RV:CCACTCCCAGTCATTCCTTTAGTG,786bp。2.方法2.1糖尿病模型的制備按體質(zhì)量隨機分出正常組10只,剩下大鼠采用單側(cè)腎切除加一次性腹腔注射STZ造模。用10%水合氯醛將大鼠麻醉后(0.4mL/100g)切除右腎,逐層縫合皮膚,術(shù)后恢復一周,按照55mg/kg一次性腹腔注射STZ,72h后隨機血糖≥16.7mmol/L,尿糖4+以上者為糖尿病造模成功。造模后按體質(zhì)量隨機分組:模型組11只,厄貝沙坦組11只(17.5mg/kg灌胃),PNS組11只(17.5mg/kg腹腔注射)。模型組和正常組每日給予等容積蒸餾水灌胃,共12周。2.2各組含藥血清糖、糖、tgf-1、pns的血清見表1大鼠腎小球足細胞復蘇,于25cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5mL含5%胎牛血清足細胞培養(yǎng)液,置于33℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。細胞分組:正常組:正常組血清6.7%;高糖組:模型組血清6.7%+葡萄糖4.5%;TGF-β1組:正常組血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL;IRB組:IRB含藥血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL;PNS組:PNS含藥血清6.7%+葡萄糖4.5%+TGF-β150nmoL。于實驗前用將處于對數(shù)生長期的各組足細胞用無血清足細胞培養(yǎng)液同步24h,然后按細胞分組加入含有含藥血清或和葡萄糖足細胞培養(yǎng)液孵育36h,按試劑盒說明提取每組足細胞總RNA,待測Caspase3mRNA。2.3觀察指標和測試方法2.3.1觀察一般情況觀察大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、體毛、飲水量、二便及活動情況等,第2、4、6、8、10、12周稱量并記錄大鼠體質(zhì)量。2.3.2測定尿蛋白第4、8、12周用代謝籠收集24h尿液,記錄尿量,用考馬斯亮藍G-250法測24h尿蛋白定量。2.3.3血清因子水平12周取血,分離血清,檢測腎功能和氧化應激相關(guān)指標。7150全自動生化測定儀檢測血清甘油三脂(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)濃度。2.3.4腎組織病理學檢測12周末取大鼠腎組織,稱重,記錄腎質(zhì)量/體質(zhì)量比,取一部分腎組織放入中性福爾馬林固定,待做HE、Mallory、Masson、六胺銀-HE染色,光鏡下觀察腎組織病理學變化,并參照文獻腎組織病理學檢查評分標準對腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷評分。2.3.5腎組織tgf-1、caspase-3蛋白表達的免疫組化12周末取大鼠腎組織,一部分放入中性福爾馬林固定,石蠟包埋,5μm切片,采用SABC免疫組化,一抗稀釋比為1∶200,進行腎組織TGF-β1、Caspase-3蛋白顯色后封片。2.3.6pc中性福爾馬林12周末取大鼠腎組織,一部分放入DEPC中性福爾馬林固定,石蠟包埋,5μm切片,按照原位雜交試劑盒中說明的方法顯示腎組織TGF-β1mRNA,封片。2.3.7pcr反應條件檢測Caspase-3mRNA。提取各組足細胞總RNA,用RT試劑盒合成cDNA。PCR試劑盒進行PCR反應,PCR50μL反應體系:TaqMasterMix,2×25μL,ForwardPrimer(10μM)2μL,ReversePrimer(10μM)2μL,Template<1μg,RNase-FreewaterxμL。PCR反應條件:(1)預變性,94℃2min;(2)變性,94℃30s;(3)退火,57℃30s;(4)延伸,72℃30s;(5)(2)-(4)步40個循環(huán);(6)終延伸,72℃5min。最后PCR產(chǎn)物電泳,當溴酚蘭移至凝膠中間時切斷電源,取出凝膠,置于凝膠成像系統(tǒng)中成像,每組實驗重復3次。2.4rt-pcr圖像分析免疫組化和原位雜交結(jié)果使用Image-ProPlus6.0專業(yè)圖像分析軟件進行圖像分析,用ImageJ圖像分析軟件分析RT-PCR圖像。用SPSS16.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,數(shù)據(jù)用表示,組間比較用方差分析,P<0.05差異有顯著統(tǒng)計學意義。糖尿病并發(fā)癥的預防STZ注射72h后,除正常組大鼠外,其余各組大鼠均有不同程度的進食增加,尿量增多,活動遲緩,消瘦。在第7周時出現(xiàn)多種糖尿病并發(fā)癥,如腹部包塊及潰瘍、白內(nèi)障等,PNS組以上述情況較模型組有不同程度改善。與正常組比較,模型組大鼠體質(zhì)量在第4周開始,大鼠體質(zhì)量明顯減輕,第8、10、12周有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。與模型組比較,IRB組、PNS組大鼠體質(zhì)量第8周后顯著增加(P<0.05),腎質(zhì)量/體質(zhì)量比顯著減小(P<0.01)。見表1。3.h尿蛋白定量的單因素試驗從第4周開始,模型組大鼠24h尿蛋白定量明顯升高,與正常組比較有顯著性差異(P<0.01),隨時間推移,模型組大鼠24h尿蛋白定量逐漸增加。與模型組比較,IRB組、PNS組第4周后24h尿蛋白定量顯著降低(P<0.05)。見表2。4.no、sod活性模型組與正常相比,血清TG、BUN、Scr、MDA均明顯升高(P<0.05),NO、SOD活性明顯下降(P<0.01)。與模型組相比,IRB組、PNS能明顯降低TG、BUN、Scr、MDA水平(P<0.05),增加NO和SOD水平(P<0.01)。見表3。5.小鼠小鼠腎間質(zhì)損傷檢查評分光鏡觀察模型組大鼠可見腎小管上皮細胞空泡樣變,腎間質(zhì)炎細胞浸潤,系膜細胞增生,系膜基質(zhì)增多,腎小球內(nèi)毛細血管擴張,腎小球囊擴張粘連,腎小球基底膜增寬,部分腎小球有壞死。見圖1。經(jīng)過評分,與正常組比較,模型組腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)損傷檢查評分顯著升高(P<0.01);與模型組比較,IRB組、PNS組腎小球硬化指數(shù)和腎間質(zhì)損傷檢查評分顯著降低(P<0.01),說明PNS能夠減輕DN腎組織病理損害。見表4。6.各組大鼠腎組織tgf-1、caspase-3表達比較圖像分析比較各組平均光密度值,正常組大鼠腎組織中有少量TGF-β1、Caspase-3表達。模型組大鼠腎組織中TGF-β1、Caspase-3表達強陽性。與模型組比較,IRB組、PNS組TGF-β1、Caspase-3表達明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表5,圖2-圖3。7.各組大鼠腎組織中tgf-5mrna表達比較鏡下可見原位雜交顯色后,TGF-β1mRNA表達在細胞質(zhì)中。正常組大鼠腎組織中有少量TGF-β1mRNA表達。模型組大鼠腎組織中TGF-β1mRNA表達強陽性。與模型組比較,IRB組、PNS組TGF-β1mRNA表達明顯減少(P均<0.01)。見表5,圖4。8.足細胞caspase-3mrna表達增加與正常組相比,高糖組和高糖加TGF-β1組足細胞Caspase-3mRNA表達顯著增加(P<0.01);IRB組及PNS組足細胞Caspase-3mRNA表達量比高糖組和高糖加TGF-β1組顯著減少(P<0.05)。見表6,圖5。pns治療腎纖維化的作用機制異病同治是中醫(yī)辨證論治體系的重要內(nèi)容之一,異病同治是指不同的疾病,在其發(fā)展過程中,由于出現(xiàn)了相同的病機,而采用同一方法治療。中醫(yī)古籍中雖然沒有記載DN病名,根據(jù)該病的臨床表現(xiàn),可以將其歸屬于中醫(yī)“腎消”、“水腫”、“尿濁”、“關(guān)格”、“腰痛”等病的范疇。目前認為該病病因病機是多因素綜合作用下形成的多臟腑病機變化,其中血瘀是DN的關(guān)鍵病機,活血化瘀法應貫穿該病治療始終。三七性溫、味甘、微苦,歸肝、胃經(jīng),具有化瘀止血、活血定痛、補虛強壯的效果,兼活血補血之功效于一身,其主要活性成分為PNS。根據(jù)異病同治理論,PNS功效切合該病的病機特點,能夠應用于治療DN。已有臨床研究報道證實PNS治療DN有效,但其作用機制尚不明確。本研究創(chuàng)新性地在中醫(yī)異病同治理論指導下,結(jié)合課題組早期的PNS有效抗多種腎病腎纖維化研究成果,從PNS延緩腎纖維化角度探討其治療DN的作用靶點和機制,充實異病同治理論內(nèi)涵。已有研究表明,足細胞凋亡損傷在DN蛋白尿的產(chǎn)生,腎功能的惡化,細胞外基質(zhì)生成和降解失衡導致腎纖維化方面有重要作用,其中腎臟氧化應激是引起足細胞凋亡的主要因素之一,TGF-β1、Caspase-3是氧化應激引起足細胞凋亡損傷的重要細胞因子。大鼠腎臟組織存在過激氧化應激反應,氧化與抗氧化的失衡加重了DN的進展。DN大鼠腎功能損害時,腎小球和腎小管細胞過度凋亡,可能是促進DN發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。例如,STZ大鼠DN與高血糖引起的腎臟組織細胞中的自由基或氧化應激水平異常有關(guān),其中活性氧簇(ROS)引起包括足細胞在內(nèi)的腎小球固有細胞凋亡。ROS刺激脂質(zhì)引起脂質(zhì)過氧化,導致反映組織細胞的脂質(zhì)過氧化速率或強度產(chǎn)物MDA增加,SOD和NO能降低氧化應激反應。TGF-β1是公認的促纖維化因子,在DN腎纖維化進展中起重要作用。Nath等報道給予過氧化氫能促進小鼠腎臟和孤立的成纖維細胞TGF-β1mRNA的表達。TGF-β1高表達能夠促進細胞凋亡,細胞凋亡增加時凋亡關(guān)鍵基因Caspase-3基因呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。本實驗中模型組大鼠24h尿蛋白定量增加,Scr、BUN明顯升高說明大鼠腎功能受損;觀察到了,腎組織腎小球和腎小管及其間質(zhì)出現(xiàn)典型的DN病理改變,腎組織中度纖維化;血清NO、SOD降低,MDA升高,說明DN大鼠處于氧化應激狀態(tài)。經(jīng)過PNS治療后,大鼠腎功能損傷得到一定程度地保護,PNS能夠降低血清TG水平,提高NO、SOD水平增強機體抗氧化能力,降低MD