基于熒光原位雜交技術的分子生物技術在污水生物處理系統(tǒng)中硝化菌群研究中的應用

基于熒光原位雜交技術的分子生物技術在污水生物處理系統(tǒng)中硝化菌群研究中的應用

在廢水生物處理系統(tǒng)中的微生物研究是廢水生物處理最基本、最重要的內容，也是廢水生物處理系統(tǒng)高效、穩(wěn)定運行的保障。傳統(tǒng)的微生物研究方法依賴純培養(yǎng)技術來分離細菌。該方法對研究廢水生物處理系統(tǒng)中的微生物系統(tǒng)存在嚴重缺陷。首先，廢水生物處理系統(tǒng)中的微生物群由各種微生物組成，具有一定的空間分布。這些微生物相互依存、競爭，并有復雜的序列關系。通過分離和培養(yǎng)細菌，我們無法獲得在自然條件下獲得微生物群結構和空間分布信息的微生物。其次，由于微生物遺傳和代謝活動的巨大影響，細菌的分離和栽培改變了微生物的生理特征和生化特征，這降低了實際工程實踐的重要性。此外，純培養(yǎng)需要很長的時間，有些菌株（如亞硝酸鹽氧化菌的nitoshun）不能通過純培養(yǎng)技術進行純分離。近年來,分子生物技術的快速發(fā)展為污水生物處理系統(tǒng)內微生物研究提供了新的分析方法和手段.污水生物脫氮包括硝化和反硝化兩大階段.其中硝化菌群是硝化階段的功能微生物,包括將NH4+-N氧化為NO2--N的氨氧化菌(Ammoniaoxidizingbacteria,AOB)和將NO2--N氧化為NO3--N的亞硝酸鹽氧化菌(Nitriteoxidizingbacteria,NOB).AOB和NOB在污水生物處理系統(tǒng)內的生物活性和菌群分布的穩(wěn)定性,是保證污水生物脫氮系統(tǒng)穩(wěn)定運行的關鍵因素之一.因此,采用分子生物技術對不同工藝、水質條件下的AOB和NOB的菌群結構、活性等進行研究分析,能夠為污水生物脫氮系統(tǒng)的長期穩(wěn)定運行提供有力保障.目前,以FISH和PCR為代表的分子生物技術已廣泛應用于污水生物處理系統(tǒng)內硝化菌群結構和生物活性的研究中,國外已有大量的相關文獻報道,但在國內還處于起步研究階段.1在環(huán)境生物原位分析中的應用FISH技術是根據(jù)目標微生物16SrRNA基因中的特異性序列,設計相應的、帶有熒光染料的寡核苷酸探針,按照堿基序列互補原則,將探針直接原位雜交到目的基因上,雜交成功的探針就會產生熒光信號.然后通過共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocallaserscanningmicroscopy,CLSM)或者熒光顯微鏡對目的基因進行定性和相對定量分析.典型的FISH圖片如圖1所示.通過選取系統(tǒng)發(fā)育中保守性不同的特異性序列,就可在種、屬水平上對微生物進行檢測.因此,FISH技術還可用于研究微生物種群的結構動態(tài)變化.自從Amann等最初將FISH應用于環(huán)境微生物的原位分析以來,該方法已被用于污水生物處理系統(tǒng)內絲狀菌、聚磷菌、硝化菌[4~5]、厭氧氨氧化菌等的原位檢測.近幾年,研究者在普通FISH的基礎上發(fā)展了幾種更為先進的分子生物學分析方法,用于對污水生物處理系統(tǒng)內硝化菌群的研究:FISH-MAR(Microautoradiography,顯微放射自顯影)技術、FISH-microelectrodes(Microelectrodes,微電極)技術和Clone-FISH技術.1.1fish-ro顯微檢測單獨采用FISH技術,并不能獲取微生物種群的生物代謝活性和生理功能的信息.而單獨采用MAR技術,卻無法對微生物種群的組成及其分布加以識別.Lee等首先將這兩種技術結合,建立了FISH-MAR方法.該方法能夠以顯微照片的形式,清晰、直觀地顯示出復雜的微生物群體的菌群結構及其原位空間分布情況,而且同時能夠反映出不同微生物種群的生物代謝活性.該方法的基本流程可總結如圖2,其核心思想是將待分析的微生物樣本放置在經(jīng)放射性物質標記的有機或無機底物中進行培養(yǎng),其中能夠吸收放射性底物的細胞將在放射自顯影的顯微圖片上呈現(xiàn)黑色的影像(MAR陽性,MAR+),而沒有吸收放射性底物的細胞則沒有影像顯示.對于異養(yǎng)型微生物通常采用14C標記的有機底物,如14C-乙酸;對于無機自養(yǎng)型硝化細菌,通常采用NaH14CO3.圖3為一典型的Fish-MAR顯微圖片,圖中的黑色細胞為吸收了NaH14CO3的化能自養(yǎng)型細菌,紅色細胞為通過FISH探針檢測到的AOB,二者的細胞數(shù)比例表示化能自養(yǎng)型細菌中AOB所占的比例;綠色細胞是FISH探針檢測到的NOB.Okabe課題組采用FISH-MAR方法對自養(yǎng)型硝化生物膜中的微生物代謝進行了研究.研究者首先將自養(yǎng)型硝化生物膜在含有NaH14CO3的底物中培養(yǎng)6h,其中自養(yǎng)硝化菌呈MAR+,異養(yǎng)菌呈MAR-.再將含MAR+硝化菌和MAR-異養(yǎng)菌的生物膜在僅含有NH4+的溶液中培養(yǎng)10d,結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)異養(yǎng)菌呈現(xiàn)MAR+,說明異養(yǎng)菌能夠利用14C標記的硝化菌細胞裂解產物或代謝產物,從而揭示了在碳源受限的自養(yǎng)型硝化生物膜中微生物在底物利用上的相互作用關系[8~9].該研究指出在碳源受限的硝化生物膜中硝化菌與異養(yǎng)菌各占50%,其中α-Proteobacteria23%、γ-Proteobacteria13%、綠色非硫細菌9%、CytophagaFlavobacteriumBacteroides2%、不能確定的微生物3%.Gieseke等也采用FISH-MAR方法對生物膜中的硝化及碳源同化進行了原位分析,進而研究不同微生物種群之間碳的轉化及同化.雖然FISH-MAR是一種研究微生物代謝及微生物種群結構的有效方法,但該方法不適于檢測目標微生物含量較低的樣品.由于其檢測手段取決于目標微生物的熒光信號和放射自顯影,所以當活性污泥中目標微生物的細胞數(shù)低于104cell/mL時,由于目標微生物的rRNA含量過低,將導致無法區(qū)分目標微生物與背景的熒光信號,從而造成無法檢測.所以,當硝化菌群沒有成為系統(tǒng)的優(yōu)勢菌群時FISH-MAR將難以取得檢測結果.1.2生物pcr檢測自養(yǎng)型硝化膜和處理市政污水的生物系統(tǒng)和生物資利用微電極技術能夠檢測活性污泥絮體或生物膜內部微小生境的環(huán)境要素,并通過這些環(huán)境要素的變化反映微生物代謝活性.FISH-microelectrodes方法將FISH技術和微電極技術二者有機地結合在一起,該方法能夠建立微生物原位空間分布、代謝活性與環(huán)境要素之間的相互關系.其中微電極能夠測量的參數(shù)主要有O2、H2S、NO3-、NO2-、NH4+和pH等.目前FISH-microelectrodes技術主要集中應用在對生物膜中微生物種群的研究.其中對于具有硝化功能的生物膜,該方法能夠確定沿著生物膜厚度的垂直方向硝化菌群的原位分布及代謝活性[12~13].Okabe課題組采用該方法研究了自養(yǎng)型硝化生物膜和處理市政污水的生物膜中AOB和NOB的原位空間分布.結果表明這兩種生物膜系統(tǒng)中Nitrosomonas是優(yōu)勢AOB,Nitrospira-like是優(yōu)勢NOB,沒有檢測到Nitrobacter.Nitrosomonas遍布整個生物膜,而Nitrospira-like以細胞聚集體的形式分布在AOB周圍.該生物膜的氨氧化區(qū)主要集中在生物膜的外層,亞硝酸鹽氧化區(qū)位于氨氧化區(qū)下面.采用FISH-microelectrodes方法也能夠很好地評價生物擴增和生物刺激對生物膜系統(tǒng)硝化功能的影響,其中FISH用于分析硝化菌群時間上的動態(tài)變化,微電極測量反映原位硝化活性.生物擴增是將富集培養(yǎng)的硝化菌投加于系統(tǒng)中,該方法能夠提高系統(tǒng)內硝化菌活性及豐度,從而快速啟動系統(tǒng)的硝化功能.生物刺激是通過提高或投加某種底物,從而促進或抑制微生物的生長.有研究者試圖提高硝化系統(tǒng)啟動階段的底物中NH4+和NO2-濃度,想藉此來刺激AOB和NOB的生長,但實驗結果表明該操作并沒有加快系統(tǒng)硝化功能的啟動,其中NO2-氧化過程并沒有受到影響,但是AOB增殖卻到了受抑制.也有研究者采用FISH-microelectrodes方法研究活性污泥系統(tǒng)中反硝化作用與硫酸鹽還原作用的相互影響,反硝化菌與硫酸鹽還原菌對有機碳源的競爭.1.3clwell-fish的實驗由于含有目的基因片段的克隆子(Clones)同樣適用于FISH檢測,因此誕生了Clone-FISH檢測方法,即采用FISH篩選陽性Clones或檢驗探針的有效性.Clone-FISH的實驗程序總結如圖4.目前將Clone-FISH方法直接用于硝化菌群的研究鮮有報道.該方法的應用主要體現(xiàn)在兩方面:一是檢驗針對硝化菌群的探針的特異性和有效性.探針是FISH應用的前提和基礎,以16SrRNA克隆子代替純培養(yǎng)的細胞作為陽性對照檢驗探針的特異性及優(yōu)化雜交條件,尤其是當某些硝化菌群無法進行純培養(yǎng)時,Clone-FISH解決了檢驗探針特異性的難題.二是用FISH篩選克隆文庫中的陽性克隆子,檢驗目的基因片段是否成功轉化.2基于pcr技術的衍生法PCR是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的分子生物技術.PCR技術解決了從環(huán)境樣品中提取的硝化菌DNA含量通常過低而不能進行相關分析的難題.目前多種基于PCR技術的衍生技術已經(jīng)廣泛應用于對污水生物處理系統(tǒng)內硝化菌群的研究,并取得了大量研究成果,深化了人們對硝化菌群的認識.2.1不同菌株的16srrna基因差異將PCR技術應用于對硝化菌群的研究中,首先要選取一段具有硝化菌群系統(tǒng)進化標記特征的DNA序列作為目的分析序列,然后根據(jù)該序列的保守區(qū)設計相應的探針和引物.其中,對AOB進行研究分析時所選取的分子標記基因一般是AOB的16SrRNA基因和amoA.對16SrRNA基因的研究給整個分子生物學研究領域帶來了革命性的影響,并擴展了人們對微生物系統(tǒng)發(fā)育的認知.16SrRNA基因具有高度的保守性,但不同微生物的16SrRNA基因的某些區(qū)域也存在著差異.這些差異可將微生物分為古細菌和細菌兩大類,并能在分類學上對微生物進行更進一步的研究.伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊的第2版中對微生物的分類和命名就是基于對不同微生物16SrRNA基因差異的分析.同樣不同種AOB的16SrRNA基因在結構上也具有差異性.依據(jù)16SrRNA基因的保守性和差異性,可確定不同種AOB的系統(tǒng)發(fā)育的相關性和進化距離.所有種類AOB的基因組中只含有一條16SrRNA基因.amoA是編碼氨單加氧酶(Ammoniamonooxygenase,AMO)的基因,AMO是AOB所特有的一種胞內酶.編碼AMO的基因簇中至少含有3個基因:amoA、amoB和amoC.其中amoA的基因產物包含AMO的活性位點,可以催化銨氧化成羥胺,并為AOB生長提供能量.不同種類的AOB含有不同拷貝數(shù)的amoA,一般AOB中含有2~3個拷貝數(shù)的amoA.Nitrosomonaseuropaea中含有2個拷貝的amoA,這2個拷貝的amoA的DNA序列上僅有一個核苷酸不同.Hommes通過突變實驗證明這2個拷貝的amoA都是功能基因,但是它們在細胞內的功能和地位卻不盡相同.Purkhold、Aakra和Nicolaisen等對不同AOB菌株的amoA和16SrRNA基因進行測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析后,發(fā)現(xiàn)大部分AOB在分別基于amoA和16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹上的分類有著高度的相似性.他們同時也發(fā)現(xiàn),盡管對AOB的16SrRNA基因和amoA基因進行定性分析時都可以反映出環(huán)境中AOB的種類,但由于不同種AOB之間的16SrRNA基因序列的高度相似性和該類型引物的非特異性,限制了16SrRNA基因類引物對AOB菌群系統(tǒng)發(fā)育樹分析的精確度.而盡管amoA不是制定系統(tǒng)發(fā)育樹的因子,但由于amoA只存在于AOB中,而且不同種AOB的amoA序列差異度超過其16SrRNA基因的序列差異度,使得amoA類引物的擴增特異性更強,因此對AOB菌群遺傳差異的分辨能力更高,從而能夠更精確地分辯出AOB的種屬.但無論是amoA類引物,還是16SrRNA基因類引物,目前都只針對β-變形菌綱的自養(yǎng)型AOB,因此在使用這兩類引物對AOB進行分析研究時都會低估環(huán)境樣品中AOB菌群的多樣性.2.2pcr-dlling-sequeng技術PCR-DGGE(PCR-denaturinggradientgelelectrophoresis,PCR-變性梯度凝膠電泳)技術是將PCR擴增產物加入到含有線性梯度變性劑(尿素和甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳.PCR擴增出來的DNA片段長度雖然相同,但是它們的堿基序列卻不盡相同.在電泳過程中,序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性,導致其在聚丙烯酰胺凝膠中電泳速度的急劇下降,從而停留在其相應的變性劑梯度位置上.再通過染色處理,聚丙烯酰胺凝膠上就會呈現(xiàn)出不同的DNA譜帶,每條DNA譜帶就代表了某一序列的DNA片段.為了避免單鏈DNA、異源雙鏈核酸分子和探針特異性等對分析結果的影響,研究者通常會在PCR-DGGE后進行克隆(Cloning)和測序(Sequencing)來進一步確定DNA序列,進而揭示樣品中微生物的菌群結構.這就形成了PCR-DGGE-cloning-sequencing技術.Cole和Luxmy利用該技術證實了生物膜系統(tǒng)內的微生物多樣性要遠遠大于傳統(tǒng)活性污泥法.Ebie和Limpiyakorn分別利用該技術對不同污水處理系統(tǒng)內的硝化菌群進行了研究,研究結果表明,盡管監(jiān)測過程中系統(tǒng)內的AOB含量保持不變,但是由于受到進水水質和溫度等外界條件變化的影響,污水生物處理系統(tǒng)內的AOB種群結構發(fā)生了巨大的變化.Mota研究間歇曝氣對硝化細菌菌群結構以及脫氮效率的影響時發(fā)現(xiàn),好氧時間與缺氧時間的長短會影響硝化菌群結構;與傳統(tǒng)理論不同的是,研究者發(fā)現(xiàn)脫氮效率與特定的AOB種群含量及AOB的菌群多樣性無關.Sundberg在對處理垃圾滲濾液的坡面漫流系統(tǒng)內AOB菌群結構進行了研究,研究發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)內的AOB菌群結構并沒有季節(jié)性的變化,但是在系統(tǒng)不同的處理單元內存在不同種類的AOB菌群.通過PCR-DGGE-cloning-sequencing技術能夠揭示污水生物處理系統(tǒng)內的硝化菌群結構及其相對含量的變化.但是聚丙烯酰胺凝膠條帶中的硝化菌DNA片段通常在500bp以下,而當從該片斷中獲得的序列少于已知序列的85%時,就不能準確地在系統(tǒng)發(fā)育樹上將該硝化菌進行分類,從而無法進一步得到該硝化菌的相關信息.而且由于配制的聚丙烯酰胺凝膠濃度的差異和該方法較低的靈敏度,限制了該技術的重現(xiàn)性以及對含量較少的微生物種群的檢測能力.2.3pcr和t-rflp分析PCR-T-RFLP(PCR-terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-末端限制性片段長度多態(tài)性)技術是對PCR擴增過程中所使用的引物一端用熒光物質進行標記.當用該引物對樣品DNA進行PCR擴增后,PCR的擴增產物就帶有了熒光標記.然后選擇適當?shù)南拗菩詢惹忻笇CR產物進行消化,就可產生不同長度的限制性片段.傳統(tǒng)的T-RFLP技術通常只使用一條帶有熒光染料的引物和一種限制性內切酶.隨著該技術的改進,有的研究者會同時使用兩條帶有不同熒光染料的引物進行PCR擴增,從而提高目標微生物的分類水平.最后利用DNA自動測序儀和帶有其它熒光染料標記的內標物對消化產物的長度進行分析,并獲得峰值圖.由于每種微生物帶熒光標記的限制性片段長度唯一,所以峰值圖中每一個峰至少代表一種微生物,每個峰面積與峰總面積的比值代表這種微生物的相對含量.相對于PCR-DGGE技術,PCR-T-RFLP技術能在相對較短的時間內對大量樣品的菌群結構進行分析.PCR-T-RFLP技術還具有較好的重現(xiàn)性和更高的靈敏度,從而該技術能夠對樣品中含量較少的微生物進行研究.自Hiraishi2000年首次報道利用PCR-T-RFLP技術分析活性污泥系統(tǒng)內硝化菌群結構以來,由于該技術在分析微生物群落動態(tài)變化上的優(yōu)勢,國內外諸多學者也相繼采用了該技術對不同環(huán)境下的硝化菌群進行了研究.Egli采用該技術對啟動階段的短程硝化反應器的硝化菌群結構進行了研究,發(fā)現(xiàn)反應器內的AOB的種群多樣性逐漸降低,而且在不同的溫度、pH和SRT條件下AOB的菌群結構是不同的.Park利用該技術探討了DO對活性污泥中AOB菌群結構的影響;并研究了奧貝爾氧化溝內AOB的菌群結構,發(fā)現(xiàn)由于氧化溝內好氧、缺氧環(huán)境的交替使得該系統(tǒng)內Nitrosospira-like的含量大大超出其他污水處理廠,而且Nitrosospira-like的存在與SND現(xiàn)象有著較好的相關性.由于PCR-T-RFLP技術要對PCR產物進行純化和脫鹽處理,所以較為耗時,費用較高.該技術方法中采用的熒光染料種類以及內標物的長度的不同可能會引起理論與實際片段長度的差異.這些差異雖然可以通過限定擴增片段的長度來解決,但是與此同時也會使得某些片段得到額外的擴增.此外由于酶切不能人為的控制,某些微生物物種可能也不存在所需要的酶切位點,這些因素都會影響該技術的精確性.2.4目標dna的定量分析獲得樣品中硝化細菌數(shù)量的信息對于進一步深入研究硝化菌群在污水生物處理過程中的作用是至關重要的.目前,國內外普遍采用實時熒光定量PCR(Real-timefluorescentquantitativePCR)技術對污水生物處理系統(tǒng)內硝化菌群進行定量分析.與傳統(tǒng)的末端監(jiān)測PCR技術不同,實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用儀器對整個PCR反應過程中的熒光信號進行實時采集,隨著反應的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線并獲得其閥值(Cyclethreshold,Ct),該Ct值與環(huán)境樣品中所含的目標DNA成反比.然后將該Ct值與標準曲線進行比較,就可以得出該樣品中目標DNA的含量.目前,實時熒光定量PCR普遍采用兩種熒光物質來進行定量分析.一種是帶有熒光染料的TaqMan探針,一種是SYBRGreen染料.除了正、反向兩條引物外,由于一條特異性探針的引入,使得TaqMan探針法相對于SYBRGreen染料法,其對目標DNA的擴增特異性更強.而SYBRGreen染料法的費用較為低廉,而且該方法中所使用的引物較TaqMan探針法更為廣泛.無論使用哪種方法首先都要建立目標DNA含量與Ct值之間的標準曲線.目前的研究者大都通過等梯度稀釋純培養(yǎng)目標菌的基因組DNA,或者PCR擴增片段,或者含有目標DNA片段的質粒來建立標準曲線.其中利用質粒建立的標準曲線的重現(xiàn)性最好.根據(jù)公式1可計算出已知濃度的DNA溶液中所含目標DNA的拷貝數(shù).PCR擴增的效率可以根據(jù)建立的標準曲線的斜率得出,正常的擴增效率應該在80%~85%之間,R2應大于0.95.式中,MW=DNA堿基對數(shù)(bp)×660daltons/bp;Daltons-道爾頓,質量單位,1克約為6×1023daltons.與傳統(tǒng)的PCR技術和FISH技術相比,由于實時熒光定量PCR具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、同時處理的樣品量大等特點,研究者已經(jīng)利用實時定量PCR技術考察了不同的污水處理工藝、運行參數(shù)對硝化菌群數(shù)量、結構的影響以及硝化細菌的數(shù)量和污水處理廠脫氮效果之間的關系[40~41].但實時熒光定量PCR過于依賴DNA的提取效率和探針、引物的特異性,在很大程度上影響了該技術對硝化細菌定量的準確性.Harms和Robinson利用實時熒光定量PCR技術對活性污泥法污水處理廠的AOB和NOB菌群進行定量研究時發(fā)現(xiàn),相對于AOB在污水生物處理系統(tǒng)內的重要作用,其定量結果偏低.有研究者通過添加已知含量的內標物來評估DNA提取和純化的效率,從而能夠更為準確地對污水生物處理系統(tǒng)中硝化菌群進行定量分析.而將實時熒光定量PCR與FISH等其他分子生物學技術聯(lián)合使用能更好地反映出硝化細菌的數(shù)量,避免單一技術所引起分析誤差.2.5aod活性成分分析RT-PCR(ReversetranscripatasePCR,逆轉錄PCR)技術將RNA的反轉錄技術和cDNA的PCR擴增技術進行結合.首先模板RNA經(jīng)反轉錄酶的作用合成cDNA;再以cDNA為模板,擴增合成目的片段.作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物.無論使用何種RNA,關鍵是確保提取的RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染.Terahara聯(lián)合應用RT-PCR技術和T-RFLP技術對啟動階段的污水處理廠內AOB的16SrDNA和16SrRNA的研究表明,AOB胞內的16SrRNA要比16SrDNA優(yōu)先增長,并且外界環(huán)境條件的變化將會影響AOB菌群16SrRNA的多樣性.盡管amoA是AMO的活性位點,但是采用普通的PCR技術對amoA基因進行分析并不能揭示amoA基因乃至AOB的活性.由于amoAmRNA在AOB體內更新速度快,其半衰期一般僅有幾分鐘,所以通過RT-PCR技術對AOB體內的amoAmRNA進行分析,能夠揭示環(huán)境因素對AOB活性的影響,從而及時獲得信息來優(yōu)化污水處理工藝.Aoi通過RT-PCR技術對生物膜反應器中的amoAmRNA的研究表明,氨氮濃度和pH是影響amoAmRNA轉錄的重要因素,其中當pH較低時,將抑制amoAmRNA的轉錄.Araki也利用Real-timePCR和RT-PCR技術對活性污泥系統(tǒng)不同反應階段的amoAmRNA的轉錄水平進行了分析.3穩(wěn)定同位素標記實驗穩(wěn)定同位素探測(Stableisotopeprobing,SIP)是指利用穩(wěn)定同位素標記細胞組分,進而識別出參與某一特定生物代謝過程的微生物種群.該方法實驗過程較安全,沒有放射性同位素的危險性.由于核酸是采用分子生物學手段分析微生物的主要對象,因此將其作為標記物.核酸分子含有碳、氮、氫和氧元素,可用于核酸標記的