珍珠對mc33-elisa細(xì)胞增殖分化間質(zhì)礦化及凋亡的影響

珍珠對mc33-elisa細(xì)胞增殖分化間質(zhì)礦化及凋亡的影響

骨質(zhì)疏松癥（op）是指骨量減少、骨組織微觀結(jié)構(gòu)改變、骨脆弱增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加的全身骨病。目前用于治療骨質(zhì)疏松的藥物主要分為兩大類:促骨形成藥物和抑制骨吸收藥物,兩者均能減少骨折發(fā)生率、增加骨礦密度,但是相關(guān)的不良反應(yīng)和高昂的費(fèi)用限制了它們的使用。珍珠作為一種名貴的中藥材,在我國的應(yīng)用已有幾千年的歷史。珍珠粉有很高的藥用價值,主要成分為碳酸鈣、蛋白質(zhì)、水分及包括鐵、鋁、鎂、鋅、硒、銅、鉀、錳、鍶、鍺等多種微量元素及多種氨基酸。董娜等利用原子吸收光譜法測定珍珠粉中的微量元素發(fā)現(xiàn),其中的鈣含量最高(377.084mg/g),是主要成分,錳、鍶、鐵、鈉的含量也較為豐富,而鋅、錳、銅的含量較少。據(jù)資料報(bào)道,珍珠粉中富含的鈣元素和多種微量元素,對骨量減少和骨小梁變細(xì)、斷裂等病理改變有明顯改善作用。本文觀察了珍珠粉以及低鈣珍珠粉對MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化、礦化和凋亡的作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。1材料和方法1.1培養(yǎng)基和試劑珍珠粉(浙江長生鳥珍珠生物科技有限公司);MTT、TritonX-100(美國Amresco公司);β-甘油磷酸鈉、維生素C(美國Sigma公司);α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(美國Gibco公司);MC3T3-E1細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);堿性磷酸酶(ALP)、考馬斯亮藍(lán)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(美國BDPharmingen公司)。1.2藥物處理和組成1.2.1合成粉體中鈣離子取珍珠粉用1mol/LHCl溶解,模擬人體胃腸道消化過程,用PBS緩沖液稀釋到一定濃度,作為珍珠粉原液。另取定量珍珠粉原液,加入硫酸鈉溶液,完全沉淀鈣離子,作為低鈣珍珠粉溶液。采用原子吸收光譜法測定珍珠粉和低鈣珍珠粉中鈣離子濃度。結(jié)果顯示,50μg/mL珍珠粉和低鈣珍珠粉中鈣離子濃度分別為18.81μg/mL和1.89μg/mL,前者為后者的9.95倍。1.2.2不同鈣粉濃度對pbs-pcr菌毒的影響設(shè)正常對照組(Control),珍珠粉組(PearlPowder,PP)和低鈣珍珠粉組(LowCalciumPearlPowder,LCa-PP)。珍珠粉和低鈣珍珠粉分別用PBS緩沖液稀釋到一定濃度,0.45微孔濾膜過濾除菌,4℃保存。臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)基配成所需濃度(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL)。1.3方法1.3.1m培養(yǎng)基MC3T3-E1細(xì)胞用10%FBSα-MEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換培養(yǎng)基,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時,用0.25%胰酶消化,做傳代培養(yǎng)。1.3.2檢測方法及檢測指數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞按1×104個/mL密度接種于96孔板,每孔100μL,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換以5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,同時按照分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL),LCa-PP(5μg/mL,50μg/mL,100μg/mL),每組6孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后,每孔加入10μg/mL,5mg/mL的MTT,4h后小心吸棄培養(yǎng)液,再在每孔加入150μLDMSO(分析純),于酶聯(lián)免疫檢測儀上570nm波長處測各孔吸光度值,結(jié)果用OD570表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.3分組、給藥及測藥細(xì)胞按1×105個/mL密度接種于24孔板,每孔1mL,10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%后,換以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成:5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,50μg/mL維生素C,10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。同時按照分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),每組6孔,連續(xù)給藥14d。給藥結(jié)束后,吸棄培養(yǎng)液,加入1%TritonX-100溶液200μL,置4℃冰箱中放置1h以裂解細(xì)胞,然后按ALP檢測試劑盒及考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法分別測定ALP值和蛋白含量,并計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的活性。1.3.4礦化結(jié)節(jié)染色MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/mL密度接種于24孔板,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80%后,換以5%FBSα-MEM培養(yǎng)液,同時加入50μg/mL維生素C及10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉,并按照實(shí)驗(yàn)分組加入5%FBSα-MEM作為Control組,受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),每組6孔,2天換液1次。于第28天先用冰PBS洗細(xì)胞2遍,加入5%的AgNO3溶液,于紫外燈下照射1h。將AgNO3溶液吸出,細(xì)胞用蒸餾水洗3遍,加入5%的Na2S2O3溶液,5min后將細(xì)胞用蒸餾水洗2遍,1%的中性紅溶液染色5min,細(xì)胞用蒸餾水洗2遍以移除多余的染液,低倍光鏡下(200×)觀察礦化結(jié)節(jié)染色情況并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.3.5對血清饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(ue0af±SEM)表示,采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)單因素方差分析方法進(jìn)行分析,組間比較采用Dunnett’stest檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1mc3t3-點(diǎn)細(xì)胞毒性檢測如Fig.1所示,與Control組相比,5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的PP和50μg/mL、100μg/mL的LCa-PP在24h作用范圍內(nèi)對MC3T3-E1細(xì)胞具有顯著性的促增殖作用(P<0.05,P<0.01)。2.2pp對alp活力的影響細(xì)胞在含有50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液中連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)給藥14d后處理。Fig.2顯示,與Control組相比,PP組和LCaPP組ALP活力分別增加了92.77%(p<0.001)、34.63%(P<0.01)。提示對處于成熟期的成骨細(xì)胞,PP和LCa-PP均能顯著促進(jìn)其分泌ALP,進(jìn)而促進(jìn)骨骼鈣化,然而,兩組之間存在顯著性差異(P<0.001),PP作用效果明顯強(qiáng)于LCa-PP。2.3礦化結(jié)節(jié)的測定MC3T3-E1細(xì)胞在含有50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)給藥28d后進(jìn)行VonKossa染色,可見礦化結(jié)節(jié)生成,VonKossa染色后呈現(xiàn)大小、形態(tài)不一的黑色陽性結(jié)節(jié)(Fig.3)。與Control組相比較,PP組和LCa-PP組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)均明顯增多,但是PP組明顯多于LCa-PP組。2.4骨細(xì)胞凋亡率由Fig.4可見,MC3T3-E1細(xì)胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h后細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,而PP組、LCaPP組成骨細(xì)胞總凋亡率與Control組相比分別下降了43.53%、35.22%,具有極顯著差異(P<0.001)。2.5ranglmrna的表達(dá)量RT-PCR結(jié)果(Fig.5)顯示,各組受試藥處理成骨細(xì)胞21d后,與Control組相比,PP組和LCa-PP組的OPGmRNA表達(dá)量高達(dá)3.57倍和2.80倍,具有極顯著性差異(P<0.001),但是RANKLmRNA的表達(dá)量各組的增加幅度相對較小,PP組為1.36倍,LCa-PP組1.51倍。結(jié)果顯示,PP組和LCa-PP組對增加OPG的表達(dá)作用強(qiáng)于對RANKL的作用。然而與Control組相比,RANKL/OPG的比值(Fig.5C),PP組和LCa-PP組都顯著性降低(P<0.001),并且兩組間存在顯著性差異(P<0.01),PP組作用強(qiáng)于LCa-PP組。2.6mc3t3-e細(xì)胞早期分化和表達(dá)量檢測RT-PCR結(jié)果(Fig.5)顯示,各組受試藥處理細(xì)胞21天后,與Control組相比,在Runx2的mRNA表達(dá)量上,PP組和LCa-PP組明顯升高,差異具有顯著性(P<0.001,P<0.05),提示PP組和LCa-PP組均可以促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的早期分化,且兩組存在顯著性差異(P<0.01),PP組作用強(qiáng)于LCa-PP組。同樣PP組和LCa-PP組均可顯著性升高OCmRNA的表達(dá)量(P<0.001,P<0.05)。提示兩組可以顯著促進(jìn)成熟成骨細(xì)胞的分化與骨形成,其中PP組效果最明顯,LCa-PP組次之,兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。3成骨細(xì)胞分化和骨髓結(jié)裂率的變化骨量的維持取決于骨形成和骨吸收的動態(tài)平衡,該平衡失調(diào)將引發(fā)骨代謝性疾病。成骨細(xì)胞來源于間質(zhì)前體細(xì)胞,是骨發(fā)生和骨形成的物質(zhì)基礎(chǔ),可合成和分泌20余種膠原與非膠原蛋白質(zhì)以及一些骨代謝的局部調(diào)節(jié)因子,在骨重建中生成類骨質(zhì)并促進(jìn)類骨質(zhì)的礦化,形成的新骨質(zhì)修補(bǔ)破骨細(xì)胞骨吸收形成的陷窩,并且可以分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化,因此在骨不斷的更新活動中是最重要的功能細(xì)胞之一。由于成骨細(xì)胞決定骨形成并維持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡,成骨細(xì)胞成骨功能減退會導(dǎo)致新骨形成減少,對骨吸收陷窩的修補(bǔ)能力減弱,造成骨小梁變細(xì)、薄弱、穿孔,骨皮質(zhì)出現(xiàn)多孔性變化。因此研究藥物對成骨細(xì)胞增殖及分化作用的影響,對于觀察藥物的療效并探索其作用途徑和機(jī)制具有重要意義。本文通過檢測細(xì)胞增殖、ALP活性、礦化結(jié)節(jié)形成、無血清凋亡作用以及骨相關(guān)基因表達(dá)來考察珍珠粉對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響。結(jié)果顯示,珍珠粉及低鈣珍珠粉在對MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟過程中有顯著性地促進(jìn)作用,并且兩者存在顯著差異,前者作用效果顯著強(qiáng)于后者。ALP是成骨細(xì)胞分化成熟的早期標(biāo)志,ALP通過分解基質(zhì)中的磷酸酯,使局部磷酸化,促進(jìn)羥基磷灰石的形成,并在局部沉積,使基質(zhì)鈣化,同時水解焦磷酸,解除對骨形成的抑制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PP和LCa-PP均可以于成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后明顯的增強(qiáng)ALP的活性,且PP顯著強(qiáng)于LCa-PP(P<0.01),說明PP和LCa-PP可以刺激成骨細(xì)胞的早期分化進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的礦化,珍珠粉中鈣成分起主要促進(jìn)作用。ALP活性的高表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志,礦化則是細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟的功能表現(xiàn)。維生素C能促進(jìn)成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原,而處于成熟期的成骨細(xì)胞具有高活性的堿性磷酸酶,能將底物β-甘油磷酸鈉的磷酸鍵斷裂,從而提高培養(yǎng)基中無機(jī)磷濃度,促進(jìn)鈣鹽沉積在膠原基質(zhì)中,因此成骨細(xì)胞在含有維生素C及β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)基內(nèi)生長能產(chǎn)生獨(dú)特的礦化結(jié)節(jié),VonKossa染色法是用于檢測鈣沉積的傳統(tǒng)手段。本實(shí)驗(yàn)中,PP和LCaPP均可以增加礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目和結(jié)節(jié)斑塊的大小,表明其促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化成熟,含鈣成分的PP組效果強(qiáng)于去除鈣成分的LCa-PP組。成骨細(xì)胞凋亡與新骨基質(zhì)礦化有關(guān),是骨代謝的一個重要過程,大約有70%,參與骨重建的成骨細(xì)胞都會凋亡。因此,絕經(jīng)后成骨細(xì)胞的異常凋亡也許會導(dǎo)致骨重建的不平衡,從而成為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PP和LCa-PP均可以抑制血清饑餓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡,表明兩者均具有抗成骨細(xì)胞凋亡的作用,兩組間不存在顯著性差異。Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族,是一種成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,能夠特異性的識別并結(jié)合許多靶基因啟動子上的PyGpyGGtPy序列,影響靶基因轉(zhuǎn)錄。Runx2主要在成骨細(xì)胞和肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá),是成骨細(xì)胞分化和功能的關(guān)鍵因子。Runx2可以誘導(dǎo)或促進(jìn)骨基質(zhì)蛋白基因的表達(dá),從而啟動未分化的間質(zhì)細(xì)胞或使已分化的其他類型的細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化,是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志性的基因。OC是由成骨細(xì)胞合成的一種非膠原蛋白,主要分布于細(xì)胞外基質(zhì),對骨基質(zhì)鈣化和礦化非常重要,是成骨細(xì)胞晚期分化的標(biāo)志。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PP和LCa-PP均可以上調(diào)Runx2和OC的基因表達(dá),說明兩者既能夠增強(qiáng)成骨細(xì)胞的早期分化又能增強(qiáng)其晚期分化,PP組作用效果強(qiáng)于LCa-PP組(P<0.01,P<0.05)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),OPG和RANKL是調(diào)控破骨細(xì)胞激活分化的重要細(xì)胞因子,分別屬于腫瘤壞死因子受體和腫瘤壞死因子超家族成員。RANKL與破骨細(xì)胞或者其前體細(xì)胞表達(dá)的一類膜受體—RANK(receptoractivatorofNF-κB)受體特異性的結(jié)合,誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為活性破骨細(xì)胞,促進(jìn)骨吸收。而OPG作為誘餌受體與RANKL結(jié)合,阻止其與RANK結(jié)合,從而抑制前體細(xì)胞激活為破骨細(xì)胞,抑制破骨細(xì)胞功能表達(dá),從而拮抗破骨細(xì)胞的骨吸收作用,所以又被稱之為骨保護(hù)素。也就是說破骨細(xì)胞的激活和分化主要取決于RANKL和OPG相對含量的比值。本實(shí)驗(yàn)中,PP和LCa-PP能顯著性增加OPG的基因表達(dá)(P<0.001),但是對RANKL的表達(dá)增加效果較弱(P<0.05,P<0.01)。OPG表達(dá)顯著增高而RANKL水平改變較小,結(jié)果就是導(dǎo)致了RANKL/OPG比率的明顯下降(P<0.001),從而說明兩者不但具有促骨形成作用,同時還可能抑制骨吸收,但兩組間存在顯著差異(P<0.01),PP組強(qiáng)于LCa-PP組。綜上所述,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示珍珠粉和低鈣珍珠粉均對體外培養(yǎng)的MC3T3-E1細(xì)胞的分化成熟過程呈現(xiàn)直接促進(jìn)作用,珍珠粉作用強(qiáng)于低鈣珍珠粉,兩組間存在顯著差異,說明珍珠粉中鈣成分對MC3T3-E1細(xì)胞分化成熟起到主要作用。然而,人體是一個復(fù)雜的環(huán)境,骨代謝受多種激素和因子的影響,藥物對骨形成的影響可能不僅僅通過其對成骨細(xì)胞的直接作用來實(shí)現(xiàn),還可通過對機(jī)體宏觀網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控來完成,其作用途徑也有待進(jìn)一步探討。取指數(shù)生長期MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/mL密度接種于6孔板,10%FBSα-MEM培養(yǎng)液,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用PBS液洗3次,再加無血清培養(yǎng)基并同時按照分組加入受試藥物PP(50μg/mL),LCa-PP(50μg/mL),以等量的1%FBSα-MEM培養(yǎng)液作為正常對照組