神經(jīng)組織染色的不穩(wěn)定因素

神經(jīng)組織染色的不穩(wěn)定因素

神經(jīng)退行性疾病是由大腦或骨髓的中樞神經(jīng)或髓鞘炎引起的。隨著時間的推移，它會變得聾啞，導(dǎo)致功能性障礙。采用常規(guī)染色技術(shù),如HE染色,疾病的某些特殊病理變化難以完全準(zhǔn)確的顯現(xiàn),而借助一些特殊染色可對某一特定結(jié)構(gòu)改變進行選擇性的浸染。但是,由于后者染色步驟過于復(fù)雜,流程相對繁瑣,受外界因素的干擾比較大,經(jīng)常導(dǎo)致染色結(jié)果的不穩(wěn)定,進而難以反映病理改變。目前,系統(tǒng)介紹神經(jīng)組織染色技術(shù)進展的文獻甚少,使得神經(jīng)病理學(xué)研究人員,尤其是初學(xué)者,難以領(lǐng)會各種染色方法的精髓。根據(jù)浸染組織的不同,將神經(jīng)組織染色分為尼氏染色、神經(jīng)元染色、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色、髓鞘染色、突觸染色和神經(jīng)纖維染色6種。本文就發(fā)展成熟的神經(jīng)組織染色方法原理、優(yōu)缺點及其病理學(xué)應(yīng)用作一綜述,并簡述其在神經(jīng)退行性疾病研究中的應(yīng)用,旨在指導(dǎo)研究者選用合適的染色方法。1尼氏染色及二甲胺四環(huán)素尼氏染色方法是德國病理學(xué)家Nissl于1892年創(chuàng)立,其主要根據(jù)是神經(jīng)元胞體內(nèi)含有大量嗜堿性的尼氏小體。當(dāng)組織與某些堿性染料(甲粉紫、甲苯胺藍、硫堇、焦油紫等)作用時,細(xì)胞中的尼氏體能夠選擇性與其結(jié)合而著色。Lindroos對尼氏染色方法進行了改良,并應(yīng)用于顱腦組織切片的病理研究。改良后的方法大大縮短了染色時間,且胞內(nèi)細(xì)胞核,尼氏體均能清晰可見。雖然尼氏染色法既可清晰辨別尼氏體以及胞核、核仁,又很容易區(qū)分軸突和樹突,但該法僅應(yīng)用于腦,脊髓等尼氏體較為豐富的組織。尼氏體受染后呈塊狀(形如虎斑)或顆粒狀,核周圍尼氏體顆粒較大,近邊緣處較小而細(xì)長。在神經(jīng)元受損時,尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失,因此根據(jù)形狀大小和數(shù)量差異,可判別神經(jīng)損傷程度。Simon等報道促紅細(xì)胞生成素對豬缺血/再灌注損傷的治療作用。經(jīng)尼氏染色、HE染色和TUNEL免疫組化染色證實,脊髓胸段神經(jīng)元損傷以及凋亡得到緩解。Pinzon等分別采用動物行為學(xué)和尼氏染色評價二甲胺四環(huán)素對脊髓挫傷大鼠的神經(jīng)保護作用。施用二甲胺四環(huán)素后,大鼠BBB評分和組織病理學(xué)均有改善。缺點是組織未干燥完全,易發(fā)生嚴(yán)重皺縮。其次,切片之后易使組織破裂,影響觀察。2銅銀染色及fj染色神經(jīng)元染色主要分為鍍銀染色和FJ染色(Fluorojadestaining)兩種方法。鍍銀染色是由Golgi于1873年建立并成功應(yīng)用于神經(jīng)元的特異性染色技術(shù)。由于神經(jīng)元具有較強的嗜銀性,當(dāng)組織處于含有銀離子的溶液中,神經(jīng)元可選擇性地浸染銀離子。然后通過甲醛溶液可將沉積在組織中的銀離子還原為銀顆粒,從而使神經(jīng)元著色。但是,Golgi法只能浸染所有神經(jīng)元細(xì)胞,難以辨別潰變的神經(jīng)元。Carlsen等發(fā)現(xiàn)組織切片經(jīng)過銅銀溶液浸染后,正常神經(jīng)元被抑制染色,從而區(qū)分出潰變神經(jīng)元,且染色結(jié)果背景清晰,潰變神經(jīng)元及其軸突結(jié)構(gòu)完整。Tenkova等在此基礎(chǔ)上對鍍銀染色進行了改進,使組織切片在4%多聚甲醛溶液中保存時間延長至6個月,仍具較好染色效果,染色結(jié)果背景呈金黃色。因而,該方法在神經(jīng)退行性疾病研究方面被諸多學(xué)者所親睞。Hall等利用銅銀染色技術(shù)對控制性皮層撞擊小鼠進行定量影像分析,同時對神經(jīng)元退變程度的空間性和時程性作了比較完整的闡述。Macauley等報道了PPT1(一種棕櫚蛋白質(zhì)硫酯酶)缺陷小鼠的小腦病理和運動障礙的結(jié)果。經(jīng)過銅銀染色后,發(fā)現(xiàn)PPT1缺失后大鼠神經(jīng)元退變程度明顯增加。但由于試劑成本較高,染色步驟較為繁瑣,耗時較長,不宜批量制作標(biāo)本,并且所需器皿均需潔凈,否則影響染色結(jié)果。此外該染色技術(shù)通常采用多聚甲醛溶液及二甲胂酸緩沖液對標(biāo)本進行灌注固定,且固定時間均需完全,否則神經(jīng)元不易被浸染或浸染不完全,因此國內(nèi)報道較少。FJ染色是近年來新興的一種神經(jīng)元染色技術(shù)。FluoroJade染料對變性神經(jīng)元具有很高親和力,在紫外線照射條件下,壞死神經(jīng)元顯現(xiàn)藍色熒光,由此對損傷神經(jīng)元進行定性,定量研究。FJ染色不僅可選擇性地標(biāo)記腦及脊髓組織切片上變性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突,而且能顯示腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和組織中淀粉樣蛋白沉積。FJ染色除了能浸染潰變神經(jīng)元外,還可以用于退變有髓纖維束的追蹤,如視神經(jīng)束等。目前用于退變神經(jīng)元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三種。與FJ和FJB染料相比,FJC染料效果更優(yōu),親和力更高,染色時間短,所需濃度低。此外,其還可與其它熒光素標(biāo)記物結(jié)合進行多重?zé)晒馊旧hidlow等采用FJC和DAPI(一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料)熒光雙染技術(shù)評價大鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)纖維損傷后神經(jīng)元退變情況。Mechírová等探討脊髓缺血/再灌注后神經(jīng)元退變,試驗前預(yù)先施用去甲腎上腺素和銀杏葉乙醇提取物EGb761的家兔,FJB染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后大鼠脊髓側(cè)角Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ對陽性神經(jīng)元明顯下降。3神經(jīng)膠體細(xì)胞染色glian3.1星形膠質(zhì)細(xì)胞染色Cajal法染色是一種選擇性浸染星形膠質(zhì)細(xì)胞的染色技術(shù)。原理是切片經(jīng)氯化金升汞溶液浸染,然后通過亞硫酸鈉溶液使星形膠質(zhì)細(xì)胞著色穩(wěn)定。缺點是染液需臨用前配制,不易保存,染色耗時長,染色結(jié)果不穩(wěn)定。Kitch等建立的星形膠質(zhì)細(xì)胞染色方法,能選擇性地浸染原生質(zhì)型或纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體,而對其他膠質(zhì)細(xì)胞的浸染具有抑制作用。但對于Ⅱ型阿爾采末病引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞病變狀態(tài)難以浸染。楊壯來在Cajal法染色的基礎(chǔ)上對組織的切片,固定,浸染等步驟進行了修改。改良后的方法使纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞染色均勻,背景淺,染色時間明顯縮短。許多神經(jīng)退行性疾病,如帕金森病、阿爾采末病,常與腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞,尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷(或退化),腦中神經(jīng)纖維叢的出現(xiàn)以及類淀粉斑有關(guān)。鄧廣斐等采用將神經(jīng)毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森病動物模型。經(jīng)碳酸銀染色發(fā)現(xiàn),帕金森病模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞增生與激活明顯。3.2銀染法浸染法1963年Naoumenko等報道采用碳酸銀法浸染小膠質(zhì)細(xì)胞,再經(jīng)過甲醛溶液還原使銀沉積在組織切片上。與常規(guī)HE染色相比,碳酸銀染色能夠顯現(xiàn)出胞體及其突起。但碳酸銀見光易分解,不易保存。但后來Gallyas報道的銀染法具有組織可于甲醛溶液中保存數(shù)年,適用于多種標(biāo)本的取材,包括冰凍切片、石蠟切片等,可批量進行染色操作,浸染過程可在鏡下操作便于控制染色時間等優(yōu)點。鄭翔等將組織標(biāo)本由原來的火棉膠處理改為石蠟處理。雖然準(zhǔn)確穩(wěn)定的浸染出小膠質(zhì)細(xì)胞,但仍存在一些缺陷,如切片厚度不能太厚,背景過深等。于騰波等探討活化的小膠質(zhì)細(xì)胞移植治療大鼠脊髓中度損傷的療效。碳酸銀染色和BBB評分結(jié)果顯示:移植組比同期對照組陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,移植組術(shù)后后肢運動功能評分較對照組明顯升高。3.3外周血神經(jīng)染色少突膠質(zhì)細(xì)胞染色原理與其他鍍銀染色技術(shù)相類似,主要依據(jù)神經(jīng)細(xì)胞嗜銀性。1930年P(guān)enfield采用DelRio-Hortega’s改良法成功浸染出少突膠質(zhì)細(xì)胞。該法對脊髓,腦干及顱腦白質(zhì)區(qū)域的少突膠質(zhì)細(xì)胞浸染可靠性好,并且還可選擇性浸染外周神經(jīng)施萬細(xì)胞的髓鞘,但染色背景較粗糙,影響觀察。1948年Grino等將鎢酸鈉添加至硝酸銀溶液中,使少突膠質(zhì)細(xì)胞的呈現(xiàn)更為清楚。少突膠質(zhì)細(xì)胞對氧具有特殊的親和力,經(jīng)過過氧化氫溶液處理后,激活了少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的碳酼基而發(fā)生顯色反應(yīng)。但此法對于細(xì)胞突起的顯示不夠清晰,操作比較繁瑣。姚竹秀將Grino法進行改進,采用Peufield染色法所用的固定劑固定組織,得到較好的染色結(jié)果,并認(rèn)為固定劑成分和酸堿度對染色的成敗大有關(guān)系。馬廷賢將銀溶液中的碳酸鈉濃度調(diào)至飽和,用DAB和H2O2對切片進行預(yù)處理,同時把浸染的時間延長和溫度升高,染色結(jié)果穩(wěn)定性和成功率大為提高。細(xì)胞形態(tài)顯現(xiàn)的原因可能是DAB對銀離子具有吸附作用,使其在膠質(zhì)細(xì)胞的胞體和突起上沉積而顯色。4髓劍的酸固定和染色髓鞘是包裹在神經(jīng)細(xì)胞軸突外面的一層膜。神經(jīng)纖維受損時,如多發(fā)性硬化癥,腦脊髓炎等疾病均可導(dǎo)致髓鞘的變形,崩解或脫失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法,利用鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應(yīng)和油溶性染料浸染法3種。媒染法主要是因為經(jīng)鉻鹽或鐵礬媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易與蘇木素結(jié)合而著色,具有操作簡單,試劑便宜的優(yōu)點。但染色結(jié)果對比度差、且分化不易掌控,較難被初學(xué)者所掌握。鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應(yīng)主要原理是:將類脂質(zhì)組織(磷脂)固定于鋨酸溶液后,能被氧化成黑色體,由此特異性鑒別髓鞘。經(jīng)鋨酸固定后的類脂質(zhì)組織不會被脂溶性溶劑溶解,提高了結(jié)果準(zhǔn)確性。但鋨酸價格昂貴,且不易久存;其次因浸透性差,經(jīng)常造成組織背景模糊,不易觀察。油溶性染料主要是指Luxol固藍,是Kluver等于1953年將其應(yīng)用于髓鞘染色。Luxol固藍在乙醇溶液內(nèi)具有與髓鞘磷脂結(jié)合染色的特性,如再經(jīng)過中性紅或焦油紫復(fù)染,不僅對髓鞘著色有一定的強化效應(yīng),而且還可浸染神經(jīng)元的胞核及尼氏體。Luxol固藍染色能夠浸染髓鞘束和單一髓鞘纖維,髓鞘著色鮮明,背景清晰。呂廣明認(rèn)為該法對于鑒定神經(jīng)髓鞘的特異性具有良好的標(biāo)記作用,常用于顯示髓鞘含量豐富的神經(jīng)傳導(dǎo)束,如皮質(zhì)脊髓束。此外,也可用來分析髓鞘再生及脫髓鞘的程度。與媒染法、鋨酸染色法相比,對比度明顯提高,特異性好,但試劑較貴,不易購買。在研究神經(jīng)退行性疾病中,髓鞘染色通常與尼氏染色相結(jié)合,使結(jié)果對比鮮明。Chen等探討3,4二羥苯基乳酸(DLA)對脊髓壓迫損傷后的炎癥影響。Luxol固藍和Nissl染色結(jié)果顯示,經(jīng)DLA施用后的大鼠,傷后d10髓鞘退變緩慢。朱桂彬等利用改良的Marsland銀染法與Luxol固藍雙重染色觀察人老年癡呆癥尸檢腦組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦組織中老年斑呈均質(zhì)的嗜銀團,神經(jīng)元纖維增粗,扭曲形成纏結(jié)清晰可見,且染色背景清晰,幾無銀顆粒沉淀。5caisalp染色目前有兩種顯示神經(jīng)突觸的方法。鍍銀染色法通常采用Cajal染色法和Golgi染色法來顯示突觸,其主要根據(jù)突觸的嗜銀性而使突觸著色。但由于過程繁瑣,染色結(jié)果不穩(wěn)定而未被廣泛使用。Singh通過改良鍍銀染色發(fā)現(xiàn),大鼠傷后d7即可在神經(jīng)纖維網(wǎng)齒狀回觀察到少量退變突觸。楊壯來將Cajal法進行改良并成功顯示神經(jīng)突觸。改良后的方法具有神經(jīng)突觸及包體內(nèi)神經(jīng)元纖維染色清晰,方法簡單,穩(wěn)定,切片可長久保存而不退色的特點。磷鎢酸染色法是利用重金屬浸染神經(jīng)突觸,然后通過電鏡觀察突觸結(jié)構(gòu)及數(shù)量變化。缺點是組織固定時需采用鋨酸,毒性較強,且價格昂貴。Shankar等通過磷鎢酸染色證實,突觸結(jié)構(gòu)及機能的可塑性變化與學(xué)習(xí),記憶功能有著密切聯(lián)系。韓玉澤等借助磷鎢酸染色電鏡觀察患有克汀病的大鼠小腦突觸分布,發(fā)現(xiàn)顆粒層中突觸數(shù)目較少,且形成不全。6金屬酶染色法神經(jīng)纖維染色也是依據(jù)神經(jīng)纖維對銀離子的特殊吸附性,但方法不同。1904年Bielschowsky等通過甲醛溶液將吸附于神經(jīng)纖維內(nèi)的銀復(fù)合物還原生成棕黑色鉻銀沉淀,但難以浸染潰變的神經(jīng)纖維。Fink等將組織切片依次浸入高錳酸鉀、草酸和苯二酚混合液、硝酸鈾進行預(yù)處理,選擇性浸染出潰變的神經(jīng)纖維。但由于銀顆粒易在正常組織中沉積,造成切片背景不清晰、潰變纖維及其終末不易辨別的缺陷。隨后,DeOlmos將組織切片先經(jīng)銅銀溶液處理,抑制正常神經(jīng)纖維浸染。該法具有染色背景清晰,潰變纖維結(jié)構(gòu)明顯可見的特點。畢彥忠等將氨銀溶液的配置方式進行簡化,使神經(jīng)纖維浸染及背景更為清晰,同時操作簡單,節(jié)省試劑成本。此外,何金鑫等報道固定液的選擇對神經(jīng)纖維染色有一定的影響,其中丙酮固定后染色效果最好。Gallyas將潰變神經(jīng)纖維染色法應(yīng)用于阿爾采末病等神經(jīng)退行性疾病的病理診斷研究。與Bodian染色法相比,該法可抑制正常神經(jīng)組織浸染,僅對神經(jīng)元纖維纏結(jié)、膠質(zhì)細(xì)胞變性,包涵體等異常結(jié)構(gòu)選擇性染色。神經(jīng)退行性疾病除了引發(fā)神經(jīng)組織自身受損外,亦會引起一些神經(jīng)毒性物質(zhì)和蛋白的異常表達。如Tau蛋白、GFAP和CR3分別為少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小