腸道菌群與肥胖及相關慢性代謝性疾病

腸道菌群與肥胖及相關慢性代謝性疾病

眾所周知，肥胖是現(xiàn)代社會面臨的嚴重公共健康問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WTO)2006年公布的數(shù)據(jù),全球已經(jīng)有超過10億的成年人超重(BMI25.0~29.9kg/m2),其中有3億人為肥胖癥患者(BMI>30kg/m2)。發(fā)達國家和發(fā)展中國家肥胖人口的比例都在不斷上升,與肥胖相關的代謝失調(diào)疾病如2型糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化及非酒精性脂肪肝等許多慢性代謝性疾病也有愈演愈烈的趨勢。如何遏制和治療肥胖及相關代謝性疾病,成為亟待解決的公共健康問題。大多數(shù)代謝失調(diào)都與糖穩(wěn)態(tài)失衡有關,繼而發(fā)展成為2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等。一方面,大量的營養(yǎng)學臨床實驗和流行病學調(diào)查表明,肥胖等慢性疾病的快速增長是由于攝入能量過多導致的能量代謝不平衡,特別是由傳統(tǒng)的植物為主的飲食轉(zhuǎn)變?yōu)閯游镄允澄餅橹鞯奈鞣斤嬍吃斐傻摹Ａ硪环矫?近十年來的研究清楚的揭示了與肥胖相伴隨的慢性炎癥在糖尿病等疾病發(fā)生發(fā)展中的關鍵作用。但是,僅僅從人或動物自身的生理機制解釋高脂或高能量飲食引起慢性低水平炎癥是相當困難的。如何才能揭示攝入高脂或高能量飲食與低水平、全身性炎癥的發(fā)生的分子機理,以及由于慢性炎癥導致的代謝綜合征的分子機理呢?近幾年來,越來越多的研究成果將人們的注意力吸引到與人類共生的腸道微生物群落和其宿主的相互作用上來了。腸道菌群與宿主的消化、營養(yǎng)、代謝、免疫等方面密切相關,是進入人體的“環(huán)境”因素,其地位與作用相當于后天獲得的一個重要“器官”。盡管對腸道菌群的多樣性和功能的認識還不全面,現(xiàn)在已知正常成年人的腸道內(nèi)的總重量有1~2kg,包含約500~1000個不同的種類,其細胞總量幾乎是人體自身細胞的10倍,其編碼的基因數(shù)量為是人體自身基因的100多倍。如此數(shù)量龐大的微生物群體,通過長期與宿主的共同進化,為宿主提供不具備的酶和生化代謝通路。腸道菌群的基因組信息的總和被稱為“腸道元基因組”(gutmetagenome),是控制人體健康的“人類第二基因組”,與人體的基因組一起,通過與環(huán)境條件的相互作用,影響著人體的生理代謝。因此,人體是一個由大量真核細胞與原核細胞共同構成的復雜系統(tǒng),正如諾貝爾獎獲得者Lederberg形容的“超級生物體(superorganism)”。腸道菌群在宿主能量代謝的調(diào)控中有著不可忽視的作用。很早人們就認識到腸道微生物區(qū)系的一個主要的代謝功能就是發(fā)酵那些不能被小腸吸收的食物殘渣和上皮細胞分泌的內(nèi)生黏液。腸道內(nèi)微生物群落的基因多樣性為這個復雜系統(tǒng)提供了很多宿主不具備的酶和生化代謝通路,使其可以通過發(fā)酵降解多糖(淀粉、纖維素、半纖維素、膠質(zhì))、沒有被吸收的寡糖來產(chǎn)生能量,而代謝的終極產(chǎn)物是短鏈脂肪酸。這些復雜代謝活動的結果就是產(chǎn)生能被宿主吸收和利用的能量和底物,并且為微生物自身的生長和增殖提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)。也就是說,腸道菌群可以通過幫助消化利用宿主自己不能利用的營養(yǎng)物質(zhì),使宿主獲得更多能量。更令人吃驚的是,美國的JefferyI.Gordon領導的小組研究表明,腸道菌群的作用不僅僅是幫助宿主從食物中獲得更多能量,更為重要的是可以直接調(diào)節(jié)宿主脂肪存儲組織的基因表達活性,使宿主增加脂肪的積累。他們通過對無菌小鼠(GF)和腸道內(nèi)定植正常菌群的普通小鼠(COVN-R)的比較,研究腸道菌群對宿主的代謝,特別是對脂肪存儲的影響。在給予相同的多糖豐富的食物(57%碳水化合物,5%脂肪)的情況下,CONV-R小鼠與GF小鼠相比,身體脂肪總量增加42%,而每天食物消耗卻減少29%。這組數(shù)據(jù)似乎只是證實了腸道菌群能夠幫助宿主消化多糖而獲得更多的能量。但接下來的分析卻證實了腸道菌群與宿主脂肪代謝的關系決不僅限于此。CONV-R小鼠相對GF小鼠身體脂肪總量增加反映的是脂肪細胞顯著的過度肥大,而非其數(shù)量的增加。菌群的定植增加了宿主腸道內(nèi)葡萄糖的吸收以及血清中的葡萄糖和胰島素含量,從而增加了兩種基礎轉(zhuǎn)錄因子——ChREBP和SREBP-1——的表達,進而誘導了肝臟的脂肪合成。微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以刺激肝臟中脂肪代謝相關的酶。甘油三酯通過脂蛋白脂肪酶(LPL)的中介作用,從肝臟進入循環(huán)系統(tǒng),進而被脂肪細胞吸收。腸上皮細胞可以產(chǎn)生一種LPL的抑制因子——禁食誘導脂肪細胞因子(Fiaf),而腸道菌群能夠調(diào)控Fiaf的表達。通過比較GF及COVN-R的野生型和Fiaf-/-小鼠,證實了Fiaf是體內(nèi)具有重要生理作用的LPL調(diào)控因子,而且是菌群誘導的脂肪存儲(肥胖)增加的重要中介因子。這一系列的研究,首次有利地證明了腸道菌群作為一種環(huán)境因素,參與宿主脂肪存儲的調(diào)控,是肥胖發(fā)生的重要原因。肥胖對宿主腸道微生態(tài)影響很大,腸道菌群的數(shù)量與組成會發(fā)生很大改變。一方面,肥胖個體的腸內(nèi)細菌過度生長可能性較高,主要可能與肥胖改變了腸的運動性有關,比如肥胖病人易患腸易激綜合征和假性結腸梗阻。還有證據(jù)表明,由于肥胖改變了機體對某些神經(jīng)肽如縮膽囊肽、鈴蟾肽等的敏感性,從而影響了腸的運動性。腸道菌群可以產(chǎn)生和代謝乙醇,對宿主乙醇代謝的研究可以表明肥胖個體腸內(nèi)細菌的過度生長。遺傳型肥胖的ob/ob型小鼠與瘦型小鼠相比,其呼出的氣體中乙醇含量較高,而對肥胖患者的臨床研究中也得出相一致的結論。另一方面,肥胖會改變腸道菌群結構和組成。Gordon和他的同事分析了5088個來自于相同飲食結構的遺傳性肥胖小鼠(ob/ob)和瘦型小鼠(ob/+,+/+)腸道末端微生物的16SrRNA基因序列,發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠腸道中擬桿菌門細菌的豐度下降50%,而厚壁菌門細菌的比例升高。對人體的研究獲得與動物實驗一致的結果,12名肥胖患者在堅持減少碳水化合物的低熱量食譜1年,體重明顯下降后,他們腸道中的擬桿菌門微生物的豐度逐漸升高,而厚壁菌門微生物的比例下降。若將肥胖小鼠(ob/ob)的腸道菌群移植至野生型GF小鼠體內(nèi),僅經(jīng)過兩周受體小鼠就會因為增加食物中攝取的能量而引起體重顯著增加。因此肥胖表型可以隨菌群在不同個體間發(fā)生轉(zhuǎn)移,菌群元基因組對肥胖表型的貢獻十分重要。在腸道菌群與宿主相互作用中,微生物影響和改變宿主的代謝絕不僅僅是使宿主獲得更多的能量這么簡單。最近通過對GF小鼠的研究,分析了其能夠抵抗高脂飲食誘導肥胖的機理。研究人員通過用高脂高碳水化合物的飼料喂養(yǎng)GF小鼠和CONV-R小鼠,發(fā)現(xiàn)后者的體重和脂肪含量顯著高于前者,而且GF小鼠對于高脂飼料誘導的糖耐受和胰島素抵抗都有一定抵抗作用。這種抵抗的分子機理涉及兩個獨立的調(diào)控脂肪酸代謝的途徑:腸道菌群的定植一方面使得Fiaf的水平降低,誘導了過氧化物酶體增殖物激活受體輔助激活因子Pgc-1α與棕色脂肪細胞的分化及其生理功能關系密切的輔助轉(zhuǎn)錄激活因子;另一方面降低了AMP活化蛋白激酶(AMPK)這一控制細胞能量代謝的關鍵酶的活性。這說明腸道菌群在飲食誘導的肥胖和糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用涉及復雜的分子機理,而不僅僅是增加了能量的獲取。雖然上述研究揭示了腸道菌群通過調(diào)控宿主脂肪存貯的相關基因和代謝通路發(fā)揮重要的作用,但是卻不能說明高脂飲食誘導的肥胖等代謝綜合癥中普遍存在的低水平慢性炎癥與腸道菌群是否有關。高脂飲食誘導的肥胖和代謝綜合癥與肌肉、肝臟和脂肪組織中多種炎性反應相關因子的表達量增加有關,比如IL-1、TNF-α、MCP-1和IL-6等。這些標記物都參與破壞胰島素功能和胰島素抵抗形成的過程。如炎性因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平上升,能夠促進胰島素受體底物I的絲氨酸位磷酸化。磷酸化導致胰島素受體底物I對胰島素敏感性下降,引發(fā)胰島素抵抗。近來,Cani等人找到了一類細菌相關的因子——脂多糖(LPS),將高脂飲食與代謝性綜合征聯(lián)系起來,對于腸道菌群與代謝穩(wěn)態(tài)平衡之間的關系提出了新的假說。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁成分,死亡的革蘭氏陰性菌的LPS與LBP形成復合物并被免疫細胞表面的CD14/TLR4受體識別時,會引起促炎因子的分泌,也被稱為內(nèi)毒素。也是通過TLR4相關途徑,LPS從腸腔經(jīng)小腸微血管進入宿主循環(huán)系統(tǒng),其在體內(nèi)轉(zhuǎn)運及代謝與脂蛋白相關。研究人員通過短時間(2~4周)高脂食物飼喂小鼠發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)LPS水平顯著升高,但是仍然遠遠低于敗血癥個體中的水平,稱為代謝性內(nèi)毒素血癥。同時,與用小鼠標準飼料(富含碳水化合物)喂養(yǎng)的動物相比,高脂組小鼠腸道內(nèi)的Bifidobacteriumspp.和E.rectale-Cl.coccoides類群的數(shù)量顯著下降,其中重要的是Bifidobacteriumspp.能夠提高腸屏障功能和降低小腸內(nèi)毒素水平。為了證明LPS是觸發(fā)代謝失調(diào)的因子,給小鼠注射低劑量的提純的LPS,使其血液中內(nèi)毒素水平與高脂組相同。實驗數(shù)據(jù)證明,上述兩組動物空腹血糖、肥胖、脂肪變性、脂肪組織巨噬細胞浸潤、肝臟胰島素抵抗、高胰島素血癥等生理改變相似。LPS的重要受體CD14是在單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞表面表達的一種復合功能的受體蛋白,給CD14基因敲除小鼠飼喂高脂飼料或注射低劑量LPS,則不會誘發(fā)代謝失調(diào)的癥狀,并且正常飼料喂養(yǎng)的CD14基因敲除小鼠對胰島素的敏感性增加。如果小鼠在飼喂高脂飼料的同時服用抗生素,則由于抗生素對腸道菌群的影響,減少了代謝性內(nèi)毒素水平,從而避免了代謝性失調(diào)的癥狀如脂肪組織發(fā)炎、巨噬細胞浸潤、氧化應激等。Cani等的上述研究有力的證明了腸道菌群產(chǎn)生的內(nèi)毒素與高脂飲食誘導的代謝失調(diào)密切相關。不僅在動物模型中,在肥胖和2型糖尿病人群研究中代謝性內(nèi)毒素血癥假說也得到一定的驗證。Creely等通過BMI、性別、年齡配對的病例—對照研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病患者內(nèi)毒素水平比正常人高2倍,而且正常人禁食后胰島素水平與其內(nèi)毒素水平相關。與之相關的研究更發(fā)現(xiàn),遺傳性肥胖小鼠(ob/ob和db/db)血液中的LPS水平較之野生型小鼠升高。而且用特異性抑制革蘭氏陰性菌的多黏菌素B處理大鼠,降低了肝臟脂肪變性。用抗生素處理ob/ob小鼠4周后,宿主體內(nèi)的內(nèi)毒素減少,炎癥及代謝失調(diào)相關的反應降低。用兩種方式切斷ob/ob小鼠體內(nèi)LPS反應途徑——使用LPS活性抑制劑和CD14敲除——發(fā)現(xiàn)動物生理反應與使用抗生素相似。以上的研究表明,腸道菌群相關的代謝性內(nèi)毒素在遺傳型肥胖動物的代謝失調(diào)中也發(fā)生著關鍵作用。另一方面,既然Bifidobacteriumspp.數(shù)量與宿主內(nèi)毒素水平、炎性反應都密切相關,Cani等通過使用益生元(寡果糖)維持Bifidobacteriumspp.數(shù)量不下降,明顯降低腸道通透性,則小鼠可以抵抗高脂飲食誘導的內(nèi)毒素水平升高及肥胖等代謝失調(diào)。其分子機制被證明是,益生元的攝入導致Bifidobacteriumspp.數(shù)量增加,使得與腸粘膜功能、腸上皮細胞增殖和分化密切相關的GLP-2表達增加,進而增加ZO-1、Occludin等的表達,腸壁通透性下降,進入宿主循環(huán)系統(tǒng)的腸道內(nèi)LPS減少,從而減輕宿主的炎性反應。因此,代謝性內(nèi)毒素血癥假說可以很好地解釋高脂或高能量飲食引起慢性低水平炎癥的機制——飲食誘導腸道菌群改變,增加了病菌的數(shù)量,減少了保護腸屏障細菌的數(shù)量,影響腸上皮細胞基因表達,導致腸道通透性增加,使得進入血液的內(nèi)毒素增加,引發(fā)慢性炎癥反應,進而產(chǎn)生肥胖、胰島素抵抗等代謝失調(diào)。以上的研究提供了大量證據(jù),表明不當飲食引起的腸道菌群失調(diào)在代謝性綜合征發(fā)生發(fā)展中扮演了極為重要的角色。元基因組與宿主基因組相比,最大的特點就是其結構具有很高的可塑性。腸道菌群結構的可塑性使之成為防治代謝性疾病很好的靶點。超級生物體可以被看作是一個會“走路”的生物反應器,類似處理廢水的連續(xù)流動培養(yǎng)裝置。因此,改變進入反應器的培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成是改變其中微生物組成的有效方法。如果要以腸道菌群作為防治相關疾病的靶點,就必須找出與宿主該疾病相關的特定細菌類群,并且解析相關細菌類群如何影響宿主代謝活性,才能有針對性的進行干預和調(diào)控。目前微生物分子生態(tài)學和元基因組學在分析腸道菌群結構組成中已廣泛應用。微生物分子生態(tài)學是以微生物的基因組DNA為分析對象,用DNA的序列多樣性反映物種的多樣性,從而克服了培養(yǎng)方法的局限性,可以比較客觀、全面、快速地分析菌群的結構組成,可以實現(xiàn)對同一個體腸道菌群結構隨疾病發(fā)生發(fā)展而變化的動態(tài)跟蹤研究,也可以對健康和疾病患者進行比較分析。PCR-DGGE和T-RFLP等DNA指紋圖譜的分子生態(tài)學技術能快速直觀地展現(xiàn)微生物群落結構的變化。隨著測序技術的不斷提高、測序成本的降低、生物信息學的大力發(fā)展,利用高通量、大規(guī)模的新一代測序技術,如454焦磷酸測序等,可以對腸道元基因組進行深度測序,更直接地獲得腸道微生物組成和功能的信息。高通量測序數(shù)據(jù)結合多變量統(tǒng)計方法,如主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別法(PLS-DA)等,使得鑒定出與宿主代謝性疾病相關的特定細菌類群成為可能。非常典型的例子就是我們實驗室以小鼠為模型,評價宿主基因和飲食在改變腸道菌群結構和調(diào)控代謝綜合征相關表型中的相對貢獻的研究。該實驗將天生表現(xiàn)出葡萄糖耐受異常(IGT)和體脂增加的Apoa-I基因敲除小鼠和野生型小鼠以高脂飼料或普通飼料飼養(yǎng)25周,以模擬人類代謝性疾病的發(fā)生過程。其中攝入高脂飼料的Apoa-I基因敲除小鼠和野生型小鼠體重明顯高于普通飼料組并且表現(xiàn)出葡萄糖代謝異常(IGT),而飼喂正常飼料的Apoa-I基因敲除小鼠體重增長不明顯,但是同樣表現(xiàn)出IGT。在四組動物中,飼喂正常飼料的野生型小鼠最為健康,意外的是,肥胖和IGT最嚴重的并非飼喂高脂飼料的Apoa-I基因敲除小鼠,而是飼喂高脂飼料野生型動物,其攝入的高脂飼料顯著多于前者。我們首先采用PCR-DGGE和T-RFLP兩種DNA指紋圖譜技術對小鼠腸道菌群整體結構進行描述,發(fā)現(xiàn)飲食結構的不同能夠解釋57%的腸道菌群的變異,而宿主基因型的不同對腸道菌群的貢獻不足12%。所有表現(xiàn)出IGT的三組動物的腸道菌群都與表型健康的飼喂普通飼料的野生型動物的腸道菌群有顯著差異。然后我們采用bar-coded焦磷酸測序的方法對16SrRNA基因V3區(qū)進行深度測序,結合偏最小二乘法判別分析鑒定出與代謝綜合征發(fā)生發(fā)展相關的特定細菌類群。我們在種的水平上,共鑒定出65個細菌類群與飲食結構差異、宿主基因型差異或宿主健康狀況相關。值得注意的是,無論基因型如何,攝入高脂飼料會使得具有保護腸屏障功能的Bifidobacteriumspp.豐度下降。Desulfovibrionaceae是一類能夠還原硫酸鹽并且產(chǎn)生內(nèi)毒素的菌,該類群產(chǎn)生的硫化氫可以損傷腸黏膜影響腸屏障功能,而內(nèi)毒素進入宿主循環(huán)系統(tǒng)可以誘發(fā)宿主免疫反應。一個屬于該科的類群在表現(xiàn)出IGT的動物中增加,特別是熱量攝入最多、代謝綜合征最嚴重的飼喂高脂飼料的野生型小鼠腸道中豐度最高。該研究表明飲食結構對于決定腸道菌群結構具有最重要的作用,不當飲食會引起特定細菌類群的改變,即使動物擁有正常的基因組,也會由于腸道菌群失調(diào)發(fā)展成為代謝綜合征。該研究也鑒定出可能與慢性炎癥和代謝性疾病相關的特定細菌類群,為在人類中研究腸道菌群與慢性代謝性疾病的關系和進行以腸道菌群為靶點的飲食干預提供了借鑒。要有效的通過調(diào)控腸道菌群來干預慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展,僅僅鑒定出與之相關的細菌類群是不夠的,還必須解析微生物與宿主之間互作關系的分子基礎以及其中細菌成員的功能,為此我們提出了一種將腸道菌群與宿主代謝表型變化加以聯(lián)系的“跨基因組”方法。結合波譜學、微生物組學和多變量統(tǒng)計學,分析7位中國家庭成員兩個時間點采集的糞便和尿液樣品,并模擬腸道菌群與宿主的代謝相關性。通過構建糞便腸道菌群的16SrRNA基因克隆文庫分析了該家庭7位成員腸道菌群的多樣性和組成結構。在種的水平,我們發(fā)現(xiàn)中國家庭成員腸道菌群的整體結構與之前已報道的美國人有顯著的差異,這一結果也與之前報道的大規(guī)模流行病學得到的兩個人群存在著微生物共代謝差異的結果相一致。通過建立擬桿菌屬(Bacteroidesspp.)類群特異性克隆文庫,對家庭成員腸道內(nèi)擬桿菌屬的多樣性進行分析,結果發(fā)現(xiàn)類群特異性文庫反映的擬桿菌屬的多樣性較通用文庫高,并發(fā)現(xiàn)很多未知的、新的擬桿菌種類。對腸道