共聚焦操作流程

、實驗環(huán)境觀察儀器是否有外表明顯損壞，如需開啟空調(diào)，一般控制在25度。拉上窗簾，避免標本熒光淬滅及雜光干擾。二、開機查看實驗記錄，確認是否馬上能開機（注意：汞燈必須在關(guān)機20分鐘以后才能再開啟，一般為30分鐘）。確認后可執(zhí)行以下操作：（務(wù)必先開電源，后開鑰匙?。。。?。1、打開PSU（主電源）2、打開激光器（只開啟需使用的激光器）1）、氬離子多線激光器（458/488/515,應(yīng)用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等）。2）MCPSU半導(dǎo)體綜合激光器（LD405應(yīng)用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635應(yīng)用染料：CY5/Alexa647等）。3）LD559激光器（注意：電源打開后不要馬上開鑰匙,等待TEMP指示燈不閃爍后,再開鑰匙,紅色指示燈不閃爍后,可正常使用）。3、打開顯微鏡電源IX2-UCB4、打開熒光汞燈（注意：開啟后,“15分鐘內(nèi)勿關(guān)”）UserID:Administrator5、打開電腦主機、顯示器，登陸windowsxp系統(tǒng)'「，雙擊共聚焦軟UserID:Administrator打開FV10-ASW應(yīng)用軟件匕wn」8888三、取圖1、DIC（微分干涉差）明場立體圖（1）、插入起偏鏡、檢偏鏡（DIC滑塊）。（2）、FV10-ASW軟件中點擊透射光觀察按鈕W打開鹵素燈快門，使用TD滑

塊（軟件TDlamp項）控制鹵素燈的光強，倒置顯微鏡下觀察標本，進行標本聚焦。1）、使用手控面板選擇合適倍率的物鏡下觀察（注意若用60X油鏡時，檢偏鏡部位要推上彎桿），并檢查各物鏡對應(yīng)的DIC元件。2）、可在檢偏鏡部位用旋鈕進行對比度的調(diào)節(jié)。（需要時可使用，一般勿調(diào)）（3）、FV10-ASW軟件中點擊透射光觀察按鈕關(guān)閉鹵素燈快門。打開DIC通道，執(zhí)行取圖操作。，進行調(diào)節(jié)步驟：適當調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)一般為能看到圖像即可），快速7fimn，進行調(diào)節(jié)步驟：適當調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)一般為能看到圖像即可），快速7fimn-I尋找焦平面，如需放大光學(xué)倍數(shù)，可適當調(diào)節(jié)。點擊，停止預(yù)1）、調(diào)節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by，點擊^刪沏快速預(yù)掃，尋找焦平面。掃描。2）、選擇AutoHV,放慢掃描速度（掃描速度越慢，掃描時間越長，圖像信噪比好，但耗時，易淬滅，一般為10-12.5us/pixel），size為640by，點擊進行再預(yù)掃，調(diào)節(jié)HV、調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)至圖象清晰尖銳即可。，停止預(yù)掃描。Mode3）、若背景噪音仍過多也可選上心山mm來降低隨機噪音干擾（次數(shù)越多降4）、點擊噪越好，但掃描時間也越長，一般在HV較高時使用）。4）、點擊并保存。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）

FilteiMode5）、去掉丨Kdlrihw，將掃描速度、size恢復(fù)至初始狀態(tài)（掃描速度至最快,即最左端，2.0us/pixel,size為512by）,為下一個標本做好準備。2、熒光圖（1）、拉出檢偏鏡（DIC滑塊），打開汞燈機械快門（shutter）。（2）、FV10-ASW軟件中點擊汞燈觀察按鈕樸，打開汞燈快門，倒置顯微鏡下觀察標本，進行標本聚焦（找視野）。使用手控面板，根據(jù)標本熒光探針選擇合適的熒光慮色片及選擇合適的物鏡下觀察,WU紫外激發(fā)/藍色熒光（eg：DAPI），WB藍色激發(fā)/綠色熒光（eg：FITC、EGFP）,WG綠色激發(fā)/紅色熒光（eg:TexasRed,Rhodamine，DsRed）。（一般要求標本在所用的各種熒光探針匹配的熒光慮色片下均能觀察到所需視野，eg：DAPI+FITC+TexasRed多色熒光探針，需在WU,WB,WG下均能觀察到所需視野，DAPI一般熒光較強，F(xiàn)ITC或TexasRed下易找些）。（注意：更換不同倍數(shù)物鏡時應(yīng)適當降低物鏡再更換，以免損壞物鏡；若用60X油鏡時，要插入檢偏鏡并推上彎桿。）（3）、FV10-ASW軟件中點擊汞光觀察按鈕E,關(guān)閉汞燈快門。執(zhí)行取圖操作。1）、點擊二___，添加熒光染料。（最多為三色，多于三色需分別掃描）若標本使用的熒光染料不是染料庫里的染料，可選激發(fā)光及發(fā)射光譜較接近的染料代替，這時可適當調(diào)整2）、調(diào)節(jié)掃描速度至最快（2.0us/pixel）,size為512by,點擊，進行快速預(yù)掃，尋找焦平面。步驟：適當調(diào)節(jié)HV、gain步驟：適當調(diào)節(jié)HV、gain及offset參數(shù)一般為能看到各通道圖像即可），快速調(diào)節(jié)尋找焦平面，如需放大光學(xué)倍數(shù)，可適當調(diào)節(jié)。點擊，停止預(yù)掃描?？焖僬{(diào)節(jié)尋找焦平面，如需放大光學(xué)倍數(shù)，可適當調(diào)節(jié)。點擊，停止預(yù)掃描。?Seqiieirtial3）、選上*L.nrlr3）、選上AutoHV（AutoHV功能為自動匹配掃描速度與HV值,不選易造成圖像出現(xiàn)強度過飽和狀態(tài)）,放慢掃描速度（一般為10-12.5us/pixel）,size為640by,點擊^：YHl，r"，ri1進行再預(yù)掃，調(diào)節(jié)HV、gain及offsetgain及offset參數(shù)至圖象清晰尖銳即可。，停止預(yù)掃描。FiterMode4）、若背景噪音仍過多也可選上人上山川|來降低隨機噪音干擾（次數(shù)越多降噪越好，但掃描時間也越長，一般在HV較高時使用）。5）、點擊k汽覆進行取圖，保存及相關(guān)圖像處理。（注意：原始圖像一定要保存為oib格式）FiteiMode6）、去掉丨憶1油泅1，將掃描速度、size恢復(fù)至初始狀態(tài)（掃描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size為512by），為下一個標本做好取圖準備。四、刻錄數(shù)據(jù)圖像保存后，退出FV10-ASW軟件，刻錄數(shù)據(jù)（注意：必須用新的光盤，嚴禁使用U盤、移到硬盤等）。五、關(guān)機務(wù)必先關(guān)鑰匙后關(guān)電源?。?！1、關(guān)閉熒光汞燈（注意：開啟后，“15分鐘內(nèi)勿關(guān)”）2、關(guān)閉激光器1）、關(guān)閉LD559激光器2）、關(guān)閉MCPSU半導(dǎo)體綜合激光器3）、氬離子多線激光器（注意：先關(guān)鑰匙，千萬別馬上關(guān)閉電源，要等風扇停止轉(zhuǎn)動后再關(guān)閉電源）3、使用擦鏡紙沾擦顯微鏡物鏡（注意：一般物鏡清洗液為乙醇，擦鏡紙