左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞骨保護(hù)素、ranklmrna表達(dá)的影響

左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞骨保護(hù)素、ranklmrna表達(dá)的影響

近年來(lái)的研究表明，成骨細(xì)胞保護(hù)素（opg）-是打破骨細(xì)胞分化過(guò)程中重要的信號(hào)傳導(dǎo)因素。在打破骨細(xì)胞生成、激活、激活和成熟過(guò)程中起著決定性作用。這是決定破骨細(xì)胞分化的非常重要因素。以往研究表明,左歸丸對(duì)卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松癥具有明顯的治療作用。實(shí)驗(yàn)采用原位雜交的方法,觀察左歸丸含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞OPG、RANKLmRNA表達(dá)的影響,以期從細(xì)胞分子水平探討左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制。1材料表面1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)備Wistar大鼠15只,雌性,體重200~220g,清潔級(jí),由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(軍)2002-001。動(dòng)物均在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室內(nèi)飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào):SYK11-00-0039。新生24h內(nèi)Wistar乳鼠,由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。1.2水觀點(diǎn)g,2.左歸丸方藥組成:熟地黃24g、山藥12g、枸杞子12g、山萸肉12g、牛膝9g、莬絲子12g、龜甲膠12g、鹿角膠12g。常規(guī)水煎制濃縮,生藥含量為5.88g/mL。此藥物濃度按照人日用臨床劑量(每日1劑,生藥含量為105g/劑),經(jīng)人-大鼠體表面積比值折算,濃縮8倍而成。1.3rangl靶基因的mrna分析DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司生產(chǎn));新生牛血清(澳大利亞PAA公司生產(chǎn));胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn));膠原酶Ⅱ型(美國(guó)Gibco公司生產(chǎn));HEPES(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn));L-谷氨酰胺(美國(guó)Amresco公司生產(chǎn));多聚賴氨酸(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn));青霉素、鏈霉素(國(guó)產(chǎn));DAB顯色試劑盒、大鼠OPG、RANKL原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。大鼠OPG原位雜交試劑盒,采用針對(duì)OPG的寡核苷酸探針,經(jīng)地高辛高效標(biāo)記。針對(duì)大鼠、小鼠的OPG靶基因的mRNA序列為:①5′-TGGACAACCCAGGAAACCTTTCCTCCAAAA-3′;②5′-TTTGCCTGGGACCAAAGTGAATGCAGAGAG-3′;③5′-AGAAATGATAGGGAATCAGGTTCAATCAGT-3′。大鼠RANKL原位雜交試劑盒,采用針對(duì)RANKL的寡核苷酸探針,經(jīng)地高辛高效標(biāo)記。針對(duì)大鼠、小鼠的RANKL靶基因的mRNA序列為:①5′-GCCAGCCGAGACTACGGCAAGTACCTGCGC-3′;②5′-GGCCAGGTGGTCTGCAGCATCGCTCTGTTC-3′;③5′-TTTATAGAATCCTGAGACTCCATGAAAACG-3′。1.4儀器和分析方法超凈工作臺(tái)(JUJIKAGAKU,日本);RKI-100-B型CO2培養(yǎng)箱(RIKA-KOGYO,日本);倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯);DMIRB+Q500IMLEICA圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司);KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);LXJ-6401離心機(jī)(北京醫(yī)療儀器修理廠);TDL-5-A電動(dòng)離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。2方法2.1左歸丸含有藥物的血清制備2.1.1動(dòng)物組將15只雌性Wistar大鼠,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、卵巢切除組、卵巢切除加左歸丸組,每組5只。2.1.2卵巢切除組血清卵巢切除組和卵巢切除加左歸丸組,摘除大鼠的雙側(cè)卵巢。在術(shù)后3個(gè)月,卵巢切除加左歸丸組大鼠灌服左歸丸,2次/d,連續(xù)5次,于末次給藥后1h,乙醚麻醉,無(wú)菌條件下,經(jīng)腹主動(dòng)脈采血,冷置1h后,離心(2500r/min,25min),分離血清,是為卵巢切除含藥組血清,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。卵巢切除組和正常對(duì)照組按以上程序,灌服等容積的蒸餾水,所取血清分別為卵巢切除組血清和正常對(duì)照組血清。2.2體外分離細(xì)胞的制備取新生24h內(nèi)的Wistar乳鼠,拉頸處死置入盛有75%酒精的容器中,消毒5~10min,取出放入平皿中。于無(wú)菌條件下取出顱蓋骨,放入4℃預(yù)冷的PBS(pH7.4)中,去除附著的骨膜及周圍的結(jié)締組織,PBS清洗2次,然后將洗凈的顱蓋骨剪成1mm×1mm小片,移入0.25%胰蛋白酶中37℃預(yù)消化15~20min,再將骨片移入另一含1g/LⅡ型膠原酶的溶液中37℃繼續(xù)消化60min,使細(xì)胞從基質(zhì)中解離出來(lái)。置上述膠原酶消化液于離心管中,1000r/min離心3min,棄上清,用DMEM培養(yǎng)液將沉淀洗1~2次后制成細(xì)胞懸液,重復(fù)以上步驟,將2次消化獲得的細(xì)胞混勻,以終濃度1×109L-1接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后換液,除去未貼壁的細(xì)胞,以后2~3d換液1次。培養(yǎng)5~7d,細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層,鋪滿培養(yǎng)瓶底,即可進(jìn)行傳代。以0.25%胰蛋白酶使貼壁細(xì)胞消化松解,輕搖培養(yǎng)瓶,細(xì)胞即脫壁,以終濃度1×107L-1接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),進(jìn)行傳代培養(yǎng),取第3代細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。2.3細(xì)胞懸液的制備實(shí)驗(yàn)分為3組:正常血清組、卵巢切除血清組、卵巢切除含藥血清組,每組8個(gè)樣本。取第3代成骨細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化,將細(xì)胞懸液以終濃度1×107L-1接種到培養(yǎng)皿中(預(yù)置多聚賴氨酸處理的無(wú)菌蓋玻片),24h細(xì)胞貼壁后換為含10%各組血清的培養(yǎng)液,培養(yǎng)72h后取出蓋玻片,PBS沖洗3次,4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC,室溫固定15min,蒸餾水充分洗滌,干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?.4原位雜交法檢測(cè)mrna表達(dá)強(qiáng)度采用原位雜交的方法,檢測(cè)OPG、RANKLmRNA在成骨細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)(用PBS代替雜交探針作為陰性對(duì)照)。細(xì)胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)好后用0.1mol/LPBS(pH7.4)洗2min×3次;固定,用4%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC,室溫固定15min,蒸餾水充分洗滌,干燥后-20℃保存?zhèn)溆?30%H2O2一份+純甲醇50份混合,室溫處理30min,蒸餾水洗滌3次;暴露mRNA核酸片斷:切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,37℃消化90s,原位雜交用PBS洗5min×3次,蒸餾水洗1次;后固定,固定液為1%多聚甲醛/0.1mol/LPBS(pH7.4),含有1/1000DEPC。室溫固定10min,蒸餾水洗滌3次;預(yù)雜交,濕盒的準(zhǔn)備:干的雜交盒底部加20%甘油20mL以保持濕度,恒溫箱40℃孵育2~4h,吸去多余液體,不洗;雜交,將雜交液滴加在玻片上,恒溫箱40℃過(guò)夜;雜交后洗滌,37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×2次;37℃0.5×SSC洗滌15min×1次;37℃0.2×SSC洗滌15min×1次;滴加封閉液,37℃30min,吸去多余液體,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60min,原位雜交用PBS洗5min×4次;滴加SABC,37℃20min,原位雜交用PBS洗5min×3次;滴加生物素化過(guò)氧化物酶,37℃20min,原位雜交用PBS洗5min×4次;DAB顯色,使用DAB顯色試劑盒。取1mL蒸餾水,加試劑盒中A、B、C試劑各1滴,混勻,加至標(biāo)本上,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在20~30min之間,蒸餾水洗滌;脫水,透明,封片,光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果判斷:成骨細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng),細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色,胞核陰性。形態(tài)計(jì)量學(xué)分析:所有標(biāo)本進(jìn)行原位雜交法染色后,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野(光鏡下放大×100),用Leica圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)OPG、RANKLmRNA表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果以平均光密度值(MOD)表示。2.5統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用單因素方差分析(one-wayANOVA),組間兩兩比較,采用SNK法。3不同濃度卵巢切除血清中rakenlmna的表達(dá)卵巢切除血清組成骨細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)的MOD值與正常血清組相比,顯著降低。與卵巢切除血清組相比,卵巢切除含藥血清組OPGmRNA表達(dá)的MOD值明顯升高;而與正常血清組相比,無(wú)顯著性差異。與正常血清組相比,卵巢切除血清組成骨細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)的MOD值明顯升高。卵巢切除含藥血清組與卵巢切除血清組比較,RANKLmRNA表達(dá)的MOD值明顯降低;而與正常血清組比較,無(wú)顯著性差異。說(shuō)明卵巢切除血清組與正常血清組相比,成骨細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)顯著下調(diào),而RANKLmRNA表達(dá)明顯上調(diào);卵巢切除含藥血清組與卵巢切除血清組相比,成骨細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)明顯上調(diào),RANKLmRNA的表達(dá)明顯下調(diào);而與正常血清組相比,無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。4左歸丸含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞rakenl表達(dá)的調(diào)控RANKL是能直接刺激破骨細(xì)胞發(fā)育和使之激活的細(xì)胞因子,它與破骨細(xì)胞表面受體RANK結(jié)合,強(qiáng)有力促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟,并抑制破骨細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)其存活。RANKL對(duì)于破骨細(xì)胞的分化是必需的,在M-CSF存在的情況下,單純給予RANKL即可刺激單核細(xì)胞前體形成抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽(yáng)性并具有骨吸收活性的多核巨細(xì)胞,這種作用不必有其他趨鈣激素或細(xì)胞因子和成骨細(xì)胞的參與。此外,RANKL還可增強(qiáng)破骨細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力并抑制破骨細(xì)胞的凋亡而間接促進(jìn)其骨吸收功能。實(shí)驗(yàn)采用原位雜交技術(shù),觀察成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL的情況。結(jié)果顯示,與正常血清組相比,卵巢切除血清組成骨細(xì)胞RANKLmRNA的表達(dá)明顯上調(diào);而在左歸丸含藥血清的作用下,成骨細(xì)胞RANKLmRNA的表達(dá)與卵巢切除血清組相比明顯下調(diào),而與正常血清組比較,無(wú)顯著性差異。由此可以說(shuō)明左歸丸含藥血清可能通過(guò)抑制成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL,抑制了破骨細(xì)胞(OC)的活性,進(jìn)而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。OPG對(duì)破骨細(xì)胞的作用是多方面的,它可以抑制破骨細(xì)胞的分化、融合、激活,并促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。OPG通過(guò)與RANKL結(jié)合,競(jìng)爭(zhēng)性抑制了RANKL與RANK的結(jié)合,而RANK是OC表面介導(dǎo)RANKL生物活性的唯一受體,所以可以特異性地抑制OC的分化和活性。研究證實(shí),OPG與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切。在體外培養(yǎng)條件下,雌激素可使成骨細(xì)胞(OB)株分泌OPG增加3~4倍,提示絕經(jīng)后雌激素水平下降進(jìn)而影響OPG分泌與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,卵巢切除血清組與正常血清組相比,成骨細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)明顯下調(diào);而在左歸丸含藥血清的作用下,成骨細(xì)胞OPGmRNA的表達(dá)與卵巢切除血清組相比明顯上調(diào),而與正常血清組比較,無(wú)顯著性差異。由此可以說(shuō)明左歸丸含藥血清可能是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)OPG,使之與RANKL的結(jié)合增多,抑制破骨細(xì)胞的功能,而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的。中醫(yī)理論認(rèn)為,腎藏精主骨生髓,骨的生長(zhǎng)發(fā)育有賴于髓的濡養(yǎng),骨髓充足,則骨就會(huì)變得堅(jiān)固有力,骨髓缺乏,就會(huì)變得脆弱易折。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,破骨細(xì)胞分化調(diào)控因子OPG、RANKL在“腎主骨”過(guò)程中起著非常重要的作用,當(dāng)破骨細(xì)胞分化調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)正常、使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞處于正常的偶聯(lián)狀態(tài)促進(jìn)骨形成時(shí),就是中醫(yī)骨髓充足的一種表現(xiàn);而當(dāng)破骨細(xì)胞分化調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)異常,使成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞偶聯(lián)