液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定曲克蘆丁血藥濃度的不確定度評(píng)定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定曲克蘆丁血藥濃度的不確定度評(píng)定

根據(jù)中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)制定的《分析不確定度的評(píng)估指南》，化學(xué)檢驗(yàn)部門應(yīng)在實(shí)施清晰度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，向檢測(cè)結(jié)果提供不確定度。一個(gè)完整的定量分析結(jié)果,不但包括測(cè)量值,還包括測(cè)量不確定度,其大小決定了測(cè)量結(jié)果的實(shí)用價(jià)值。ISO17025要求,合格的分析實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)證書或報(bào)告,都應(yīng)該包含有關(guān)校準(zhǔn)或測(cè)試結(jié)果不確定度評(píng)定的說明。不確定度對(duì)于控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法具有非常重要的意義。為此本文對(duì)LC-MS/MS檢測(cè)曲克蘆丁血藥濃度的方法進(jìn)行不確定度評(píng)定,控制分析方法的關(guān)鍵步驟,減小不確定度,為方法學(xué)研究提供有益的指導(dǎo)。材料和方法1試劑:merk公司曲克蘆丁滴丸,規(guī)格:每粒10mg,批號(hào):071007;曲克蘆丁片,規(guī)格:每片60mg,均由南京天澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司提供;內(nèi)標(biāo):芍藥苷,批號(hào):110736,中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇,色譜純,Merk公司生產(chǎn);試驗(yàn)用水均為去離子水;其余試劑均為分析純。MicromassQuattromicroLC-MS/MS聯(lián)用儀,包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、2695液相色譜儀和Masslynx4.0質(zhì)譜工作站,美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;BS124S電子天平,德國(guó)Sartorrius公司產(chǎn)品;Micromax3591臺(tái)式高速離心機(jī),賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。2血漿樣本的測(cè)定2.1檢測(cè)離子msr色譜條件:色譜柱為HanbonKromasilC18(2.1mm×150mm,5μm);流動(dòng)相為0.02%甲酸的水溶液-甲醇(55∶45);流量0.2mL·min-1;柱溫40℃。離子檢測(cè)方式為MRM多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè);離子化方式:氣動(dòng)輔助電噴霧離子化(ESI+)。曲克蘆丁:[M+Na]+峰m/z765.5,子離子m/z457.1;芍藥苷:[M+Na]+峰m/z503.4,子離子m/z219.1。2.2固相萃取小柱的制備于2mL離心管中精密加入血漿樣品1mL,內(nèi)標(biāo)溶液10μL,渦旋30s,加入10%高氯酸600μL,渦旋1min,于15000r·min-1室溫離心5min。吸取上清液至10mL離心管中,加入pH7.00的磷酸鹽緩沖液1.4mL,渦旋30s。用甲醇1mL活化固相萃取小柱,再用pH7磷酸鹽緩沖溶液1mL平衡小柱。將混合后的溶液上樣后,用5%甲醇水溶液1mL淋洗,洗脫液棄去,最后用含1%甲酸的甲醇溶液0.5mL洗脫,洗脫液收集至10mL離心管中,經(jīng)40℃空氣流吹干后,用甲醇-水(50∶50)溶液80μL復(fù)溶,15000r·min-1離心5min,取上清溶液,進(jìn)樣10μL。2.3標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿的制備稱取曲克蘆丁10mg,置于10mL容量瓶中,加入純水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得1mg·mL-1曲克蘆丁的儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液25μL加入純水定容至10mL得2.5μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2.5μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液400μL,加入純水稀釋至10mL容量瓶,配成濃度為100ng·mL-1的曲克蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2mL離心管,精密加入曲克蘆丁100ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)貯備液10μL及空白血漿1mL,渦旋混勻,得1ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿。加入內(nèi)標(biāo)10μL。3血樣量化療效標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)文獻(xiàn)方法按照以下4個(gè)步驟進(jìn)行:①規(guī)定被測(cè)量;②識(shí)別不確定度來源;③不確定度分量的量化,包括:標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度、提取回收率、重復(fù)性;④計(jì)算合成不確定度,對(duì)濃度為1ng·mL-1的血樣,進(jìn)行不確定度評(píng)估。其中,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度符合三角分布。標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度采用加權(quán)方法來計(jì)算。結(jié)果1不確定因素的原因根據(jù)檢測(cè)過程分析,評(píng)定其中主要來源,見圖1。2不確定組件對(duì)各不確定度分量作圖,見圖2。由圖2可見,提取回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不確定度的主要分量。3擴(kuò)展不確定度評(píng)定將各分量按照不確定度傳播律合成:Urel=0.26。取包含因子k=2,則相對(duì)擴(kuò)展不確定度:UrelEErel=U×k=0.52,擴(kuò)展不確定度:UE=UrelEErel×C=0.53ng·mL-1。不確定度的來源評(píng)定不確定度的方法有自底向上(bottom-up)法、自上向下(top-down)法、基于方法學(xué)驗(yàn)證(validation-based)方法、擬合方程(Fitness-function)法等。本文用方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)和自底向上相結(jié)合的方法,對(duì)體內(nèi)藥物的不確定度評(píng)估。結(jié)果表明,提取回收率和標(biāo)準(zhǔn)曲線是最主要不確定度分量。其中,因標(biāo)準(zhǔn)曲線分量依賴于濃度范圍和重復(fù)次數(shù),在實(shí)際操作中,主要考慮前處理過程的不確定度,前處理不確定度還可以再繼續(xù)細(xì)化,以找出影響這一步驟的較大因素,優(yōu)化前處理方法,使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本實(shí)驗(yàn)中這一分量主要來源于固相萃取(SPE),而影響SPE的重復(fù)性的因素很多,包括固相小柱的類型、批次、柱的制備,以及沖洗、洗脫、吹干、復(fù)溶等一系列環(huán)節(jié)。這些不確定度可用靈敏系數(shù)來定量。文獻(xiàn)報(bào)道,用PB設(shè)計(jì),即每個(gè)因素選高低2水平,k個(gè)因素有2k次試驗(yàn),將各因素高低水平結(jié)果的平均均值相減,可篩選出主要影響因素。若對(duì)前處理過程的影響因素,采用PB設(shè)計(jì),繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),有可能找出前處理過程中的最主要不確定度來源。方法驗(yàn)證中的精密度和不確定度都可表示為95%的置信區(qū)間,但2者內(nèi)涵不同。對(duì)同一實(shí)驗(yàn),精密度指的是隨機(jī)誤差的大小,每次精密度實(shí)驗(yàn)都相當(dāng)于1次抽樣,抽樣結(jié)果是不恒定的;而不確定度是指真值所涵蓋的某一概率(一般是66.7%或95%)區(qū)間,與分析儀器、方法及條件有關(guān),在重復(fù)性條件下,同一方法不同