白莖結(jié)構(gòu)及內(nèi)生真菌的研究

白莖結(jié)構(gòu)及內(nèi)生真菌的研究

b.黑市。白芨為我國傳統(tǒng)中藥,以其干燥的塊狀假鱗莖入藥,可用于咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒和皮膚皴裂等,現(xiàn)代科學研究證實可以治療肝癌以及血管瘤等病癥,具有較高的藥用價值。同時,白芨植株矮小健壯,花色為紫紅色,且花形奇特,具有較高的觀賞價值,因此市場需求不斷增加。目前野生白芨遭到無限制的采挖,同時,其自然生境也遭到嚴重破壞,已被《中國植物紅皮書———稀有瀕危植物》第1冊收錄,同時也被寫入了1997年制定的《華盛頓公約》,即《瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約》(ConventiononInternationalTradeinEndangeredSpeciesofWildFaunaandFlora,CITES)保護種類。只有通過人工栽培,才能既滿足市場需求,又保存目前已經(jīng)十分稀少的野生白芨資源。白芨的人工栽培多以分株繁殖為主,很多科研工作者已進行了組織培養(yǎng)研究[5,6,7,8,9,10,11,12,13],但仍存在培養(yǎng)周期較長、生產(chǎn)成本高、且幼苗在煉苗及移栽后生長狀況較差和成活率低等一系列實際問題,尚鮮見白芨組培苗規(guī)?；庇膱蟮馈Ｒ虼?在白芨的實際生產(chǎn)和種植過程中,仍以塊莖的分株繁殖這一無性繁殖方式為主,因此對白芨塊莖進行研究對白芨人工栽培具有十分重要的意義。白芨塊莖在國外文獻一般記錄為假鱗莖(pseudobulb),在中國植物志中也記錄為假鱗莖,但因國內(nèi)大部分文獻記錄為塊莖,該文亦采用塊莖一詞。白芨地下有菌根和塊莖兩種結(jié)構(gòu),均與白芨的繁殖和生長發(fā)育有關(guān),此前已經(jīng)對白芨的菌根進行了研究,觀察及實驗表明白芨形成菌根,并分離出了多種真菌。塊莖生長于地下,是白芨的藥用部位,又可用于營養(yǎng)繁殖,其結(jié)構(gòu)如何,是否會受到真菌的侵染,均與白芨的人工栽培密切相關(guān)。因此該研究擬對白芨的塊莖進行切片觀察,揭示其顯微結(jié)構(gòu),同時進行真菌分離實驗,以確定白芨塊莖內(nèi)是否有真菌感染。在此基礎(chǔ)上,探討了白芨塊莖的結(jié)構(gòu)和功能的相互適應(yīng)性,以便為白芨的栽培提供一些借鑒。1材料和方法1.1野外采集及土壤樣品采集供試材料野生白芨分別采自云南省5個縣市(玉溪市江川縣李家山、昆明市郊區(qū)長蟲山、楚雄市蒼嶺鎮(zhèn)謝柳屯后山、楚雄州元謀縣羊街以及大理州巍山縣巍寶山),野外采集后連同原生地土壤帶回溫室栽培。試驗時材料取自溫室栽培的白芨。1.2方法1.2.1白多糖的檢測取出白芨塊莖,在流水下沖洗干凈,切成約0.4cm×0.8cm,厚約0.3cm的小塊,固定于FAA固定液48h以上。材料固定后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟制片(切片厚度10μm),番紅固綠對染,加拿大樹膠封片,用OLYMPUSBX-51觀察,cellSens[Vers.1.4]顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照。同時,還進行塊莖中白芨多糖的組織化學定位實驗,采用高碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS反應(yīng))檢驗多糖的含量和貯藏部位。按照常規(guī)石蠟切片法制片,切片脫蠟至蒸餾水步驟,流水沖洗10～15min,然后用0.5%高碘酸處理15min左右,蒸餾水洗滌,再用Schiff試劑處理30min,漂洗液漂洗3次,常規(guī)石蠟切片法制片,乙醇梯度脫水,固綠對染,二甲苯透明,加拿大樹膠封片,用O-LYMPUSBX-51觀察,cellSens[Vers.1.4]顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照。1.2.2表面消毒的制備真菌分離實驗用PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g(沸水煮30min后4層紗布過濾取其濾液),葡萄糖20g,瓊脂15～20g,水加至1000mL,自然pH。121℃滅菌25min。每升培養(yǎng)基中加100μg·mL-1的硫酸鏈霉素和青霉素G鈉以抑制細菌生長,倒平板備用。取生長健壯的白芨塊莖,沖洗去除表面附著物質(zhì),用沾有肥皂粉的毛刷清洗表面,流水沖洗30min后晾干,然后依次用滅菌水沖洗1次,75%的酒精溶液消毒30s,滅菌水沖洗1次,0.1%汞處理10min,滅菌水清洗5次,取最后一次清洗后的洗液作為對照組,以檢查表面消毒是否徹底。然后把消毒好的塊莖切成0.5cm×0.5cm,厚度為0.2cm左右的小塊,將切好的塊莖水平放置PDA平板上,每皿5個小塊,于28℃保溫箱中倒置培養(yǎng)7d。2結(jié)果與分析2.1白莖的基本組織白芨的塊莖具有單子葉植物類型的莖結(jié)構(gòu)特征,具一層厚的表皮細胞,無氣孔(見圖版1中的2),表皮內(nèi)有下皮層(見圖版1中的2),下皮層內(nèi)為薄壁組織構(gòu)成的基本組織,多數(shù)小型維管束星散分布于薄壁組織中(見圖版1中的3)。白芨塊莖的表皮細胞為長方形,細胞壁顯著加厚,外被極為發(fā)達的角質(zhì)層(見圖版1中的2),表皮細胞間排列緊密,表面觀為不規(guī)則型細胞緊密鑲嵌而成,沒有氣孔分布于表皮細胞間,亦沒有任何表皮毛(見圖版1中的1,2)。緊貼表皮的一層細胞,細胞壁也有一定程度的加厚而沒有內(nèi)容物,故定義為下皮層(見圖版1中的2)?；窘M織由兩種細胞構(gòu)成,一種細胞較大,橫切面約為圓形,細胞內(nèi)部沒有營養(yǎng)物質(zhì)積累,但常具有針晶束,為儲水細胞(見圖版1中的4,6);另一種細胞較小,細胞內(nèi)積累了眾多的顆粒物質(zhì),為營養(yǎng)細胞,在靠近維管束的地方更多(見圖版1中的5)。PAS顯色反應(yīng)結(jié)果表明,營養(yǎng)細胞內(nèi)的顆粒普遍顯紅色,因此為糖類物質(zhì)多。儲水細胞遠較貯藏細胞為大,2種細胞有比較規(guī)則的排列規(guī)律,即一個大的儲水細胞周圍由一圈營養(yǎng)細胞包圍(見圖版1中的4,6)。白芨塊莖的維管束都比較小,星散分布于基本組織中,維管束由木質(zhì)部和韌皮部構(gòu)成,木質(zhì)部并沒有呈現(xiàn)強烈木質(zhì)化,木質(zhì)部和韌皮部的排列并沒有呈現(xiàn)明顯的方向性,同一個切面上同時存在靠內(nèi)和靠外的木質(zhì)部、韌皮部(見圖版1中的5)。維管束外無明顯的維管束鞘,韌皮部的外側(cè)有少數(shù)纖維細胞構(gòu)成的束鞘纖維群(見圖版1中的5)。整個白芨塊莖中起支持機械作用的主要在木質(zhì)部導管和束鞘纖維。塊莖的表皮細胞完整沒有破損,整個塊莖中沒有發(fā)現(xiàn)任何菌絲,說明塊莖內(nèi)沒有真菌侵染。2.2白豆菌的培養(yǎng)實驗對多個地點采集的白芨塊莖進行實驗,在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后,仍沒有任何菌絲生長,表明白芨塊莖內(nèi)沒有真菌共生或感染。3白莖的結(jié)構(gòu)白芨的塊莖正式名稱應(yīng)為假鱗莖,中國植物志稱假鱗莖,國外文獻一般稱假鱗莖(pseudobulb),因國內(nèi)文獻大部分稱塊莖,該文仍稱為塊莖。然而其它蘭科植物中與之相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)是假鱗莖。對比其結(jié)構(gòu),它們都具有植物莖的基本結(jié)構(gòu)特征,即維管束分散排列,沒有像根中那樣形成一個完整的中柱,以此與根相區(qū)別。白芨塊莖結(jié)構(gòu)具有單子葉植物莖的基本特征,即多個維管束星散狀分布于基本組織中,而具體每一部分的細胞又適應(yīng)于自身環(huán)境與功能而具有特定的特征:一是表皮細胞的細胞壁強烈加厚,外被一層極厚的角質(zhì)層,而表皮之下的一層細胞也加厚成為下皮層;二是基本組織中兩種不同的細胞分別積累不同的物質(zhì),大的儲水細胞儲存水分和無機鹽,具有儲水的功能,小的貯藏細胞儲存多糖等營養(yǎng)物質(zhì),二者共同執(zhí)行貯藏營養(yǎng)的功能;三是機械組織成分較少,整個結(jié)構(gòu)中沒有大的支撐結(jié)構(gòu),具有支撐功能的僅有維管束中的木質(zhì)部細胞極厚和韌皮部外少數(shù)纖維細胞。鄭小珠和杜泉基曾經(jīng)報道過白芨的塊莖結(jié)構(gòu),他們將白芨塊莖基本組織中的薄壁細胞分為粘液細胞和一般的薄壁細胞,分別與目前指的儲水細胞和貯藏細胞相對應(yīng)。因國外早在19世紀后期就有關(guān)于假鱗莖結(jié)構(gòu)的研究,經(jīng)過和國外文獻比較,仔細對比該文研究的結(jié)果,儲水細胞中以水和無機鹽為主,幾乎沒有其它的顆粒物質(zhì),這從廣泛存在于其中的草酸鈣針晶束就可以看出,而貯藏細胞中的多糖顆粒才是白芨顯粘性的原因,因此該文取儲水細胞和貯藏細胞的說法,他們指的粘液細胞即該文中的儲水細胞,而未特指的薄壁細胞即該文的貯藏細胞。對比其它植物的相應(yīng)結(jié)構(gòu),可以更好地理解白芨塊莖結(jié)構(gòu)及其功能。國外有一些蘭科植物的解剖學研究中涉及到假鱗莖的結(jié)構(gòu),如Stern、Judd和Yukawa等在蘭科Catasetinae亞族和蘭屬Cymbidium的解剖學研究中都有對假鱗莖的研究。它們的基本結(jié)構(gòu)相似,由一層較厚的表皮細胞和內(nèi)部基本組織構(gòu)成,維管束散生于基本組織中,但與白芨明顯不同的是這些在內(nèi)部基本組織中,除了儲水細胞外,另一些細胞內(nèi)貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)很少,而在靠近表皮的幾層薄壁細胞內(nèi)還含有葉綠體,可以進行光合作用,因此這些細胞被稱為同化細胞,即假鱗莖的基本組織由儲水細胞和同化細胞構(gòu)成。此外,這些蘭科植物中韌皮部外側(cè)的束鞘纖維極為發(fā)達,很多幾乎形成3、4圓周,成為一個蓋在韌皮部外的“帽子”,大大增強了假鱗莖的支撐功能。這些結(jié)構(gòu)上的差別主要是生長環(huán)境和所承擔的功能不同引起的。大部分這些假鱗莖生于地上莖的基部,不具有營養(yǎng)繁殖的功能,主要起對抗不良環(huán)境的作用,所以它們的結(jié)構(gòu)傾向于進行一定的合成并且儲存水分以防止干旱,因此發(fā)展出發(fā)達的儲水細胞,另一類普通薄壁細胞則保留有光合作用的功能,成為同化細胞。而作為莖的基部,假鱗莖還要支撐整個枝條,所以韌皮纖維非常發(fā)達。白芨塊莖生活于地下,主要功能是營養(yǎng)繁殖,故塊莖的內(nèi)部細胞發(fā)展為貯藏營養(yǎng)的貯藏細胞而不是同化細胞,以供新植株生長需要。根據(jù)過去的研究,白芨塊莖的主要成分為白芨多糖,根據(jù)普通切片可以看到細胞內(nèi)的很多顆粒,即為多糖顆粒,這些糖類物質(zhì)在新植株發(fā)出時很容易轉(zhuǎn)換為植物所需的營養(yǎng)。此外,白芨作為地下的假鱗莖,主要用于營養(yǎng)繁殖,并不起支持作用,所以其纖維等機械組織都很不發(fā)達,僅有維管束外具有少量細胞構(gòu)成的韌皮纖維群,有一定的機械支持作用。白芨的根和塊莖都生活于地下,而白芨的根始終與真菌形成共生的菌根,這不禁讓人對塊莖也產(chǎn)生疑問,但該文切片觀察并未發(fā)現(xiàn)真菌菌絲,真菌分離實驗的結(jié)果也沒有培養(yǎng)出真菌,從兩個角度證明白芨塊莖中沒有任何真菌感染。分析白芨的塊莖結(jié)構(gòu),從角質(zhì)層到表皮到下皮層,形成了一個連續(xù)的隔離保護層,