膠體磨包合冬蟲夏草的工藝研究

膠體磨包合冬蟲夏草的工藝研究

活血止痛膠囊具有活血、祛瘀、止痛的功能。這是臨床常用的中藥。冰片在處方中作為佐使之藥,起開竅醒神、清熱止痛的功效,中醫(yī)理論認(rèn)為其走竄力強(qiáng),具有輔助藥性的作用,“獨(dú)行則勢弱,佐使則有功”,可以“引藥上行”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,冰片不但具有抗炎、抗菌、止痛的作用,還可以促進(jìn)藥物透皮吸收,促進(jìn)藥物透過血腦屏障,促進(jìn)提高藥物體內(nèi)濃度。但是冰片沸點(diǎn)低,室溫即升華,原工藝將冰片粉碎成細(xì)粉直接加入,灌裝膠囊,冰片損失量較大。并且藥物在儲(chǔ)存的過程中也存在著冰片逸失而影響藥物質(zhì)量的問題。使用β-環(huán)糊精將冰片包合,可以大大提高其穩(wěn)定性,減少在制劑和貯存過程中的損失。常用的飽和水溶液快速攪拌法包合溫度高、時(shí)間長,包合效果欠佳,超聲等其他方法的包合效果與快速攪拌法相似,而采用膠體磨碾法包合,具有包合溫度低、時(shí)間短、包合率高、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。本文對該方法包合冰片的工藝進(jìn)行了研究,并采用氣相色譜法將β-環(huán)糊精對有效成分龍腦的包合效果列為指標(biāo),評價(jià)包合工藝的優(yōu)劣,為生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供了更加準(zhǔn)確而可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1儀器、試劑和試藥TM-40膠體磨,天津市鑫普機(jī)械制造有限公司;GC-14B,日本島津;N-2000雙通道色譜工作站,浙江大學(xué)智能信息工程研究所;KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超生儀器有限公司;DZF-1B型真空干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;LXJⅡ型離心沉淀機(jī),上海醫(yī)療器械三廠。龍腦:株州松本林化有限公司,含量為99.6%;冰片化學(xué)對照品:中國藥品生物制品檢定所,批號(hào):742-8902;β-環(huán)糊精:中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號(hào)T20030603;其他試劑為分析純。冰片:購自株州松本林化有限公司,經(jīng)鑒定符合2005年版《中國藥典》一部冰片項(xiàng)下之規(guī)定。2方法和結(jié)果2.1包組分中龍腦含量的測定2.1.1高水勢,低柱溫度,現(xiàn)有火炬系統(tǒng),理論塔板數(shù),集料,2,低柱濾料,5,55;理論塔板數(shù),以龍腦計(jì),2020FID檢測器,FEG-20M毛細(xì)管柱30m×0.53mm,固定膜厚度1μm,柱溫120℃,進(jìn)樣口溫度210℃,檢測器溫度230℃,載氣為N2,N2壓強(qiáng)75KPa,H2壓強(qiáng)50KPa,空氣50KPa,分流比1∶5,理論塔板數(shù)(以龍腦計(jì))4600,分離度2.109,拖尾因子1.044。2.1.2溶液的制備精密稱取水楊酸甲酯適量,加入乙醇,制成1mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液備用。精密稱取龍腦適量,用乙醇溶解,配制成1mg/ml的龍腦標(biāo)準(zhǔn)品溶液,取2ml置于10ml量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml,用乙醇稀釋至刻度,混勻,即為對照品溶液。2.1.3供試品溶液的制備精密稱取代測包合物樣品適量,置于10ml量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml,用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,超聲20min,冷卻至室溫,定容,過濾,即為供試品溶液。2.1.4線性關(guān)系的考察精密量取2.1.3項(xiàng)下龍腦標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2ml、1ml、2ml、4ml、6ml置于10ml量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液2ml,用乙醇稀釋至刻度,混勻,各樣品量取1μl進(jìn)樣,記錄峰面積,以龍腦峰面積與水楊酸甲酯峰面積比值為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為:Y=-0.0368+6.68407X,r=0.9999,表明龍腦在0.02mg/ml～0.6mg/ml間有良好線性關(guān)系。2.1.5峰面積測定分別精密吸取對照品溶液1μl,連續(xù)進(jìn)樣6次,測定峰面積,計(jì)算比值峰別1.423、1.429、1.431、1.416、1.422、1.4303,RSD=0.41%。2.1.6龍腦平均含量取正交試驗(yàn)第7號(hào)樣品,按照2.1.3項(xiàng)下操作,平行重復(fù)5次,進(jìn)樣測定(6.82%、6.71%、6.79%、6.85%、6.96%),龍腦平均含量為6.826%,RSD=1.34%。2.1.7穩(wěn)定性測定取正交試驗(yàn)第7號(hào)樣品,按照2.1.3項(xiàng)下方法操作,放置0h、3h、6h、12h、24h進(jìn)行測定,龍腦含量分別為0.06825%、0.06794%、0.06812%、0.06790%、0.06877%,RSD=0.51%,結(jié)果表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.8加標(biāo)回收率試驗(yàn)取已知含量的正交試驗(yàn)7號(hào)樣品,按測定含量時(shí)取樣量的50%精確稱量,加入適量龍腦標(biāo)準(zhǔn)溶液和2ml內(nèi)標(biāo),按照2.1.3項(xiàng)下處理樣品,測定并計(jì)算回收率,98.34%、96.31%、97.04%、98.21%、97.48%、95.84%,RSD=1.04%。2.1.9龍腦含量測定采用2.1.2項(xiàng)下龍腦標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法,配制冰片待溶液,連續(xù)進(jìn)樣三次,測得冰片中龍腦含量為62.69%、62.84%、62.21%,平均含量為62.58%。2.2膠體磨合與婆羅洲正交試驗(yàn)2.2.1開動(dòng)機(jī)磨包合物的制備按照正交表的安排,取一定量的β-CD,加入規(guī)定倍量的水研勻,倒入膠體磨中,開動(dòng)機(jī)器(3000r/min),調(diào)節(jié)磨間距為5μm,緩慢連續(xù)滴加用適量乙醇溶解的冰片,碾磨一定時(shí)間,于40℃真空干燥24小時(shí),用適量乙醇洗滌3次,40℃回風(fēng)干燥,即得包合物。2.2.2包合物的篩選通過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察,影響碾磨法包合效果的主要因素有:冰片與β-CD的摩爾比例、包合時(shí)間和加水量3個(gè)因素,因此采用L9(34)正交設(shè)計(jì),以包合物中龍腦含量和龍腦利用率為評價(jià)指標(biāo),并采用綜合評分法,龍腦含量和龍腦利用率權(quán)重系數(shù)分別為0.3和0.7,分析優(yōu)選最佳工藝。因素及水平劃分見表1,正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。龍腦含量和龍腦利用率計(jì)算公式如下:2.3龍腦利用率綜合評價(jià)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對不同指標(biāo)進(jìn)行直觀分析、方差分析和各因素水平的均值多重比較分析,并結(jié)合綜合評分法檢驗(yàn)分析結(jié)果,見表2～9。以包合物中龍腦含量為指標(biāo),極差分析可知各因素影響大小排列為A>C>B,A因素有顯著性差異,其水平優(yōu)劣排列為:2>1>3,其中2和3、1和3水平間有顯著性差異,1和2水平間無顯著性差異。B因素各水平間沒有顯著性差異,水平排列為:2>3>1。C因素水平排列順序?yàn)?>3>1,其中3和1、2和1水平間有顯著性差異,2和3水平間無顯著性差異。以龍腦利用率為指標(biāo),分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,由極差分析可知,各因素對該指標(biāo)影響大小的排列順序?yàn)锳>C>B,A因素有顯著性影響,其水平優(yōu)劣排列為:3>2>1,其中3和1、2和1水平間有顯著性差異,3和2水平間無顯著性差異。B因素各水平間沒有顯著性差異,水平排列為:3>2>1。C因素水平排列順序?yàn)?>3>1,其中2和1、3和1水平間有顯著性差異,2和3水平間無顯著性差異。以包合物龍腦含量為指標(biāo)的工藝為A2B2C2,以龍腦利用率為指標(biāo)的工藝為A3B3C2。綜合兩個(gè)指標(biāo)的分析結(jié)果,對于物料比例,由于兩次不同指標(biāo)的評價(jià)結(jié)果中1和3水平分別較差,且與其他兩水平比較具有顯著性差異,因此可以剔除,而選擇2水平為最佳水平。對于碾磨時(shí)間2和3水平的比較中,兩指標(biāo)的評價(jià)結(jié)果均較好,且沒有顯著性差異,因此進(jìn)一步比較二者不同指標(biāo)下均差所占均值比例的大小,比值分別為:0.001682、0.003798,比值較大說明差異相對較大,該因素選擇3水平。因此綜合分析確定最佳工藝為A2B3C2。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際要求,賦予兩指標(biāo)不同權(quán)重系數(shù):包合物龍腦含量0.3,龍腦利用率0.7,采用綜合評分法進(jìn)一步綜合分析,并檢驗(yàn)上述結(jié)果,見表7、表8。對綜合評分結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析,由極差分析可知,各因素對該指標(biāo)影響大小的排列順序?yàn)锳>C>B,3個(gè)因素水平優(yōu)劣排列依次為2>3>1、3>2>1、2>3>1,雖然A因素有顯著性影響,但2和3水平間無顯著性差異,因此,所得工藝為A2B3C2。又由水平分析表可知,B因素的2和3水平間沒有顯著性差異,且均差很小,結(jié)合生產(chǎn)的實(shí)際情況,縮短磨碾時(shí)間,選擇A2B2C2為最佳工藝更為合理,符合生產(chǎn)實(shí)際要求。2.4磨爾比11、制備工藝驗(yàn)證試驗(yàn)對優(yōu)化所得的最佳工藝A2B2C2,即物料磨爾比1∶1、碾磨時(shí)間40min、加水2倍量,進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn),測定結(jié)果見表9,說明該工藝穩(wěn)定可行。3包組分驗(yàn)證3.1醋酸乙酯提取液的制備稱取包合物100mg,置具塞離心管中,加醋酸乙酯10ml,超聲處理10min,離心(2500r/min)10min,傾出上清液,為醋酸乙酯提取液,備用;殘?jiān)訜o水乙醇10ml,超聲處理20min,離心(2500r/min)10min,傾出上清液,為無水乙醇提取液,備用。另取冰片對照藥材10mg,加醋酸乙酯10ml溶解,作為對照品溶液,備用。取上述三種備用液依次點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙烷(8∶2)為展開劑,5%香草醛濃硫酸試液為顯色劑,105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。在醋酸乙酯提取液色譜中沒有斑點(diǎn)出現(xiàn),而在無水乙醇提取液色譜中,與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上,日光下顯相同的2個(gè)藍(lán)紫色斑點(diǎn)?？梢姲衔锎_已形成,并且包合前后主成分沒有發(fā)生變化。3.2物相及物理混合物圖譜DSC圖譜顯示,包合物在60℃處沒有冰片的特征峰,而且在190.6℃有一個(gè)較強(qiáng)吸熱峰出現(xiàn),物理混合物圖譜僅是冰片與β-環(huán)糊精峰的疊加,新的物相的生成說明包合物確已形成。4龍腦和異龍腦包合物的特性4.1膠體磨制備β-環(huán)糊精包合物的原理是依靠一對錐形轉(zhuǎn)齒和定齒的相對運(yùn)動(dòng),使物料通過可調(diào)節(jié)的間隙受到剪切、碾磨、攪拌、高頻震蕩,使包合客體與主體充分接觸、撞擊而進(jìn)入β-環(huán)糊精空腔,達(dá)到包合效果。使用膠體磨制備β-環(huán)糊精包合物的產(chǎn)品得率高,包合時(shí)間短、溫度低、產(chǎn)量大,占用空間小,工藝條件易控制,適合企業(yè)工業(yè)化大量生產(chǎn)。采用本工藝制備冰片β-環(huán)糊精包合物,龍腦的包合率可以達(dá)到99.44%,高于文獻(xiàn)報(bào)道。使用膠體磨制備冰片β-環(huán)糊精包合物,在文獻(xiàn)中尚未見有報(bào)道。4.2以往文獻(xiàn)是將包合物收率和冰片的包合率設(shè)定為正交試驗(yàn)的評價(jià)指標(biāo),在測定過程中是以龍腦和異龍腦的總峰面積計(jì)算含量。而本文采用膠體磨制備β-環(huán)糊精包合物,不但收率高而且可控,因此未將其設(shè)定為評價(jià)包合工藝的指標(biāo),并且本試驗(yàn)首次采用了藥效成分龍腦的利用率及其在包合物中的含量的為評價(jià)指標(biāo),這樣既可以保證包合效果,又可以提高主藥含量,使評價(jià)結(jié)果更加準(zhǔn)確,同時(shí)也降低了β-環(huán)糊精的用量,達(dá)到節(jié)約成本的目的。在測定龍腦利用率的過程中,探討了該測定方法的準(zhǔn)確性和可靠性。4.3在測定龍腦利用率的過程中,筆者對文獻(xiàn)報(bào)道的使用無水乙醇萃取和乙酸乙酯萃取使冰片包合物脫包的兩種不同方法進(jìn)行了比較,結(jié)果同一樣品采用不同溶媒脫包的最終測定結(jié)果相差較大,前者為后者的1.4倍,驗(yàn)證了宋氏的試驗(yàn)結(jié)果。4.4本實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5軟件包統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),在方差分析后用t檢驗(yàn)完成各水平間的配對比較,進(jìn)行均值多重分析,該方法可以直觀地指示出因素各個(gè)水平間是否具有顯著性差異及差異的大小,直觀反應(yīng)