DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯

第四章DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯

DNA復(fù)制

(replication)

——

由親代DNA合成兩個(gè)相同的子代DNA的過程（DNA指導(dǎo)的DNA生物合成）。

復(fù)制親代DNA子代DNA一、復(fù)制可能的幾種方式全保留式半保留式混合式DNA復(fù)制方式——密度梯度實(shí)驗(yàn)

含重氮-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液第二代梯度離心結(jié)果

－半保留復(fù)制

(semi-conservativereplication)

當(dāng)DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開成兩條單鏈，各自作為模板合成與之互補(bǔ)的新鏈。在子代DNA雙鏈中，一條是來自于親代，另一條完全重新合成。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制

半保留復(fù)制

按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義

遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對(duì)的。二、DNA半保留復(fù)制所需條件：模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈；底物（substrate)

:

4種脫氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶（DDDP），簡(jiǎn)寫為DNA-pol；如何獲得單鏈DNA模板？？多種蛋白質(zhì)參與（以大腸桿菌為例）解鏈酶（helicase）；單鏈結(jié)合蛋白（single－strandDNAbindingprotein，SSB）；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNAtopoisomerase

）解鏈酶（helicase)

——

利用

ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解鏈方向拓?fù)洚悩?gòu)酶解除超螺旋DNA線性雙螺旋從中間解鏈上下都過度擰緊超螺旋進(jìn)一步解鏈就更加困難拓?fù)洚悩?gòu)酶I切開超螺旋的單鏈，再連接成雙鏈。無需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶II切開超螺旋的雙鏈，解除超螺旋，再連接成雙鏈。參與復(fù)制全過程DNA聚合酶的分類1、原核生物的DNA聚合酶：DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢDNA聚合酶——DNA生物合成

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ

）和Klenow片段

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ－復(fù)制中DNA鏈延伸

※大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ（一）DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段

大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ是單一多肽鏈的多功能酶，分子量為102kD，它具有3種酶活性：①5

→3

DNA聚合酶活性。②3

→5

核酸外切酶活性。③5

→3

核酸外切酶活性。（DNA合成）（校對(duì)）（切除RNA引物和突變序列）

5

至3

的聚合活性

dTTP3'(dNMP)n+dNTP

(dNMP)

n+1+ppi3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppi

TDNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

聚合反應(yīng)的特點(diǎn)：1、聚合反應(yīng)具有方向性:5

3

2、DNA聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸鏈不斷延長(zhǎng)。5’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’3

5

外切酶活性

5

3

外切酶活性?切除引物或突變的DNA片段辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，將其水解－校對(duì)

核酸外切酶活性

真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

后隨鏈合成先導(dǎo)鏈合成DNA修復(fù)起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用？線粒體DNA復(fù)制DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

復(fù)制的保真性(fidelity)

DNA聚合酶對(duì)模板的依賴性，是子鏈與母鏈能準(zhǔn)確配對(duì)的保證。復(fù)制過程中，復(fù)制的保真性至少依賴三種機(jī)制：1、遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律2、聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)時(shí)對(duì)堿基的選擇功能3、復(fù)制出錯(cuò)時(shí)DNA-pol的及時(shí)校讀功能DNA復(fù)制中為何需RNA引物？DNA聚合酶沒有從頭催化2個(gè)游離的脫氧核苷三磷酸聚合的能力；只能在3’-OH端與按堿基配對(duì)的dNTP進(jìn)行反應(yīng)，生成磷酸二酯鍵；引物提供游離的3’-OH末端；引物酶和引發(fā)體引物酶(

primase

)在模板的復(fù)制起始部位催化NTP的聚合,形成短片段的RNA。這一小段RNA作為復(fù)制的引物（primer），提供3

-OH末端，使DNA-pol能夠催化dNTP聚合。依賴DNA的RNA聚合酶引物酶與其他和復(fù)制有關(guān)的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物。引發(fā)體（primosome）DNA連接酶(DNAligase

)連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。ATPDNA連接酶在DNA修復(fù)、重組、剪接中也起連接缺口的作用。OHPDNA復(fù)制過程G1G2SM哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成(synthesis)期人為分成：起始、延長(zhǎng)、終止三個(gè)階段一、復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：1、DNA解開成單鏈，提供模板2、生成引物，提供3-OH末端

相關(guān)的幾個(gè)概念：1、復(fù)制起始點(diǎn)（E.coli-oriC）GATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATTACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串聯(lián)重復(fù)序列反向重復(fù)序列5

3

5

3

復(fù)制時(shí)DNA雙鏈解開分成二股單鏈?新鏈沿著張開的二股單鏈生成，復(fù)制中形成的這種Y字形的結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。2、復(fù)制叉（replicationfork）3

5

5

3

新鏈3

5

3

5

親代DNA復(fù)制方向原核生物例如E.coli，是從固定的復(fù)制起始點(diǎn)開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制

稱為雙向復(fù)制（bidirectionalreplication）

3、雙向復(fù)制DnaA蛋白辨認(rèn)起始點(diǎn),形成起始復(fù)合物DnaB蛋白解螺旋DnaC蛋白協(xié)助DnaB在多種蛋白質(zhì)參與下，DNA解開成單鏈HU蛋白促進(jìn)起始SSB維持單鏈穩(wěn)定引物合成DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶OHSSB3

5

3

5

真核生物的染色體龐大、復(fù)雜，有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)DNA片段的復(fù)制。兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子（replicon）。真核生物也是雙向復(fù)制。二、復(fù)制的延長(zhǎng)DNA聚合酶催化游離的脫氧核苷酸結(jié)合到新鏈3’末端，使其不斷延長(zhǎng)。5’3’5’DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（一）復(fù)制延長(zhǎng)的過程dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTP領(lǐng)頭鏈(leadingstrand

)

順著解鏈方向生成的子鏈，其復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，所得到一條連續(xù)片段的子鏈。5’3’3

5

3

5

解鏈方向

（二）復(fù)制的半不連續(xù)性3

5

3

5

解鏈方向復(fù)制方向與解鏈方向相反，須等待解開足夠長(zhǎng)度的模板鏈才能繼續(xù)復(fù)制，所得到一條由不連續(xù)片段組成的子鏈。隨從鏈

(

laggingstrand

)

岡崎片段（Okazakifragment）

3’5’3’3’5’三、復(fù)制的終止原核生物的復(fù)制終止1.多為環(huán)狀DNA分子，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)（ter）處匯合。5`5`5`RNA酶OHP5`DNA聚合酶dNTP5`5`PATPADP+Pi5`5`DNA連接酶2.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接真核生物的復(fù)制終止1，染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止5`5`5`5`水解、聚合、連接5`5`5`5`

2，連接不連續(xù)片段端粒（

telomere）真核生物染色體線性DNA分子末端的特殊結(jié)構(gòu)1、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1）由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成2）末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、T堿基的短序列。2、功能1）維持染色體的穩(wěn)定性2）維持DNA復(fù)制的完整性TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶（

telomerase）1一種RNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合物

2一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶,能依賴自身的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA

特點(diǎn)：功能：

復(fù)制終止時(shí)，染色體線性DNA末端確有可能縮短，但通過端粒酶的作用，可以補(bǔ)償這種由除去引物引起的末端縮短。telomerase端粒酶與藥物hTR和hTERT核酶逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3-疊氮胸苷（AZT）四、其他復(fù)制方式滾環(huán)復(fù)制rollingcirclereplicationDNA復(fù)制

概念:半保留復(fù)制,半不連續(xù)復(fù)制(前導(dǎo)鏈,后隨鏈),岡崎片段

DNA復(fù)制的酶學(xué)

DNA聚合酶(DDDP,多功能酶)

5’-3’聚合酶活性---依賴模板的新鏈延伸3’-5’外切酶活性---校讀5’-3’外切酶活性---切除引物與突變片段DNA復(fù)制的酶學(xué)

起始階段---獲得單鏈模板解螺旋酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶,單鏈結(jié)合蛋白等端粒（telomere）與端粒酶（telomerase）端粒功能

1）維持染色體的穩(wěn)定性

2）維持DNA復(fù)制的完整性第四節(jié)反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄

(reversetranscription)

以RNA為模板，合成與其互補(bǔ)的DNA的過程,也稱逆轉(zhuǎn)錄

。RNADNA反轉(zhuǎn)錄酶①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。反轉(zhuǎn)錄酶的作用－合成cDNA：反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）

是依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板，4種dNTP為底物，催化合成DNA，此過程稱為反轉(zhuǎn)錄過程。反轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶。5

3

3

5

RNA(用表示)RNA-DNA雜化分子3

5

RNase（核酸酶H活性)

DDDP（DNA聚合酶活性）

4種dNTP

RDDP（反轉(zhuǎn)錄酶）引物、4種dNTP病毒雙鏈DNA用表示）（cDNA第二鏈(complementaryDNA，cDNA)與病毒RNA互補(bǔ)的DNA(用表示)5

3

3

5

5

3

5

3

反轉(zhuǎn)錄酶的作用轉(zhuǎn)錄(

transcription

)生物體以DNA為模板合成RNA的過程轉(zhuǎn)錄RNADNA

轉(zhuǎn)

錄

的條件：原料

:

4種NTP(ATP,

UTP,

GTP,CTP)模板

:單鏈DNA

酶

:RNA聚合酶其他蛋白質(zhì)因子復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同?？相同點(diǎn)模板：DNA

原料：核苷三磷酸

合成方向：5′→3′方向依賴DNA的聚合酶遵守堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律產(chǎn)物為多聚核苷酸鏈不同點(diǎn)

復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板兩股鏈均作為模板一條模板鏈原料dNTPNTP

聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產(chǎn)物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRNA…

配對(duì)A-T；G-CA-U；T-A；G-C★

引物需RNA引物--------★方式半保留復(fù)制不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

DNA模板

5

3

3

5

模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈（templatestrand）

codingstrand不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

（asymmetrictranscription）*

在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；*

模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。

轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性/進(jìn)行性

固定的起點(diǎn)和終點(diǎn)

嚴(yán)格遵守堿基互補(bǔ)

保真性低于復(fù)制104－106轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域;DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板需解決兩個(gè)問題：

模板和RNA聚合酶的辨認(rèn)、結(jié)合5

3

3

5

結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol——啟動(dòng)子（promoter)RNA聚合酶識(shí)別,結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段高度保守性DNA序列，稱為

36512決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄

150618催化功能

155613結(jié)合DNA模板

70263辨認(rèn)起始點(diǎn)亞基分子量功能

原核生物的RNA聚合酶

核心酶

coreenzyme全酶

holoenzyme

保守序列（一致性序列）開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35

區(qū)(Pribnowbox)結(jié)合部位，影響啟動(dòng)子復(fù)合物形成；TATAATPuATATTAPy-10

區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

識(shí)別部位，還決定啟動(dòng)子強(qiáng)度；原核生物啟動(dòng)子（Sextama框）間隔區(qū)

原核生物的轉(zhuǎn)錄起始2DNA雙鏈解開,形成轉(zhuǎn)錄空泡1RNA聚合酶全酶(2)與模板結(jié)合

3

在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)–

5’-pppGpN

–OH+ppiRNApol-DNA-pppGpN-OH

pppGNTPpppGpN-OHppi起始復(fù)合物:5’-pppG-OH+

NTP5

3

DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶

轉(zhuǎn)錄終止------RNA聚合酶在DNA模板上停止前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來

原核生物的轉(zhuǎn)錄終止子（terminator）1、依賴ρ因子（Rho)

的轉(zhuǎn)錄終止2、不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止

DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT

DNA或UUUU˙

˙

˙

˙

˙

˙CAAUCAA莖環(huán)結(jié)構(gòu)RNA5’pppG53

35莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止：1，使RNA聚合酶變構(gòu)2，使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放RNA-pol

真核生物的RNA聚合酶

種類

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

對(duì)鵝膏蕈堿的反應(yīng)45S-rRNA

前體hnRNA，snRNA

5S-rRNAtRNA、snRNA耐受

極敏感中度敏感轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物啟動(dòng)子一種多種下游啟動(dòng)子

真核生物的轉(zhuǎn)錄起始

也需要RNA聚合酶辨認(rèn)、結(jié)合轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的順式作用元件，生成起始復(fù)合物。順式作用元件

------

真核生物結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)控區(qū)存在的相似或一致性的DNA序列。

-GCGC---CAAT---TATA轉(zhuǎn)錄起始

TATA盒（-30～-25）

CAAT盒(-75)

GC盒(-90)基因

增強(qiáng)子(enhancer)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率順式作用元件RNA聚合酶II啟動(dòng)子DTATAABDNATATAFE反式作用因子

------

直接或間接辨認(rèn)、結(jié)合順式作用元件并影響其功能的蛋白質(zhì)。

RNA聚合酶與模板DNA的結(jié)合需一系列轉(zhuǎn)錄因子(TF)的參與。RNA聚合酶真核生物的轉(zhuǎn)錄終止——和轉(zhuǎn)錄后加工密切相關(guān)5’------AAUAAA-5’------AAUAAA--Poly(A)mRNA核酸酶-GUGUGUGAATAAAGTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)5’5’3’3’RNA-pol

蛋白質(zhì)的生物合成

——翻譯(p182)

翻譯（translation）是指以新生的mRNA為模板，把核苷酸的三聯(lián)體遺傳密碼翻譯成氨基酸序列，合成多肽鏈的過程，是基因表達(dá)的最終目的。

模板：mRNA

原料：20種編碼氨基酸氨基酸運(yùn)載體：tRNA

場(chǎng)所：核蛋白體酶：氨基酰-tRNA合成酶、轉(zhuǎn)肽酶蛋白質(zhì)因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延長(zhǎng)因子（elongationfactors,EF）釋放因子（releasefactors,RF）核蛋白體釋放因子（ribosomalreleasefactors,RRF）蛋白質(zhì)生物合成體系mRNA是翻譯的直接模板

開放閱讀框架（openreadingframe,ORF）

mRNA從5’→3’方向，由起始密碼子到終止密碼子的序列，稱為一個(gè)開放閱讀框架。

遺傳密碼（geneticcodon）

開放閱讀框架內(nèi)每3個(gè)堿基組成的三聯(lián)體，決定一個(gè)氨基酸，稱為遺傳密碼。

遺傳密碼的特點(diǎn)（一）連續(xù)性（commaless）（二）方向性（sideness）（三）簡(jiǎn)并性（degeneracy）（三）擺動(dòng)性（wobble）（四）通用性（universal）（五）偏愛性（biasorpreference）AUGUGAUAAUAG密碼子反密碼子密碼的擺動(dòng)性

mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子相互辨認(rèn)，大多數(shù)情況下是遵從堿基配對(duì)規(guī)律的。但也可出現(xiàn)不嚴(yán)格的配對(duì)，這種現(xiàn)象就是遺傳密碼的擺動(dòng)性。開放閱讀框架OpenReadingFrame-GACUACAAGGUAUGCCCUUGCUUCACAUGUAAACGC-mRNA翻譯起始點(diǎn)5’非翻譯區(qū)3’非翻譯區(qū)起始密碼AUG終止密碼UAA、UAG、UGAmRNA上從翻譯起始點(diǎn)開始，三個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸。從起始AUG密碼到終止密碼（UAA）前的序列，代表整個(gè)一條多肽鏈的氨基酸信息，稱為“開放閱讀框架”（ORF）。這些堿基的替換、插入、缺失，都可能造成密碼的混亂和氨基酸序列的改變，稱為“frameshift，或者框移”。核蛋白體是肽鏈合成的場(chǎng)所

核蛋白體由大、小亞基組成，每個(gè)亞基含有不同的蛋白質(zhì)和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。30S60S40S50S70S80S肽鏈合成的“裝配機(jī)”－核蛋白體大亞基

轉(zhuǎn)肽酶與GTP酶活性小亞基

mRNA與tRNA結(jié)合的識(shí)別SD序列（Shine-Dalgarno)

原核生物特有的、位于mRNA上起始密碼子上游的一段富含嘌呤（AGGA)堿基的短序列，是mRNA與核糖體小亞基結(jié)合位點(diǎn)，直接影響翻譯效率，又稱為核蛋白體結(jié)合位點(diǎn)（ribosomalbindingsite，RBS）。密碼子反密碼子氨基酰-tRNA合成酶－－氨基酰-tRNAThrTyr蛋白質(zhì)因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延長(zhǎng)因子（elongationfactors,EF）釋放因子（releasefactors,RF）小亞基大亞基mRNA5’3’氯霉素：作用于大亞基，阻斷延伸鏈霉素和卡那霉素：作用于小亞基，使構(gòu)象改變，引起讀碼錯(cuò)誤S四環(huán)素：抑制氨基酰tRNA與核蛋白體的結(jié)合IF2干擾素：誘導(dǎo)eIF2磷酸化。蛋白質(zhì)生物合成的阻斷劑

翻譯后加工翻譯后加工（post-translationalproces