納米銀細菌纖維素復(fù)合抑菌材料的制備及性能研究

納米銀細菌纖維素復(fù)合抑菌材料的制備及性能研究

細菌纖維（bc）是由微生物發(fā)酵而成的高簇狀生物。它具有高結(jié)晶度和高化學純度。細菌纖維具有高耐水性、高泡沫和良好的滲透性。研究表明細菌纖維素可以用于治療皮膚損傷、褥瘡、潰瘍,目前已發(fā)展成人工皮膚和創(chuàng)可貼等傷口敷料商品。Sanchavanakit等利用人類角化細胞和成纖維細胞來評價細菌纖維素膜的潛在生物作用機理,研究結(jié)果證明了細菌纖維素膜支持人類角化細胞的生長、增生和遷移。Czaja等研究了細菌纖維素在治療二級和三級燒傷方面的應(yīng)用前景,結(jié)果顯示細菌纖維素是一種很好的促進燒傷愈合的材料。細菌纖維素具有治療中能減少疼痛、覆蓋傷口緊密,發(fā)炎時能吸收滲出物,具生物相容性,能在傷口中創(chuàng)造和維持濕的環(huán)境,防止體液流失等眾多優(yōu)勢。雖然研究結(jié)果表明BC是一種用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的潛在材料,但是由于BC本身沒有抗菌活性,不能防止傷口的感染,在保持BC生物相容性和理化特性的同時賦予其可控的抗菌性能對其在生物醫(yī)用領(lǐng)域特別是皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中的應(yīng)用有重要意義。銀做為一種對人體毒性很小的重金屬離子,是一種具有廣譜抗菌性的抑菌材料,幾乎對所有的細菌都有抑制作用,并且不會產(chǎn)生細菌抵抗性。在BC納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中復(fù)合單質(zhì)銀或者含銀化合物也是賦予BC抑菌性能常用的手段之一[8,9,10,11,12,13,14,15,16]。本實驗采用銀氨溶液與氧化細菌纖維素中醛基的氧化還原反應(yīng)在細菌纖維素的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中原位生成納米銀顆粒,賦予細菌纖維素材料優(yōu)異的抗菌性。1x射線衍射分析實驗材料:細菌纖維素由海南億德食品有限公司提供。實驗所需的Westar胎鼠,由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。所用AgNO3、NaOH、NaIO4等原料試劑均為分析純,購自北京醫(yī)藥公司。實驗使用的儀器包括:上海(上海光譜儀器公司)SP-3800系列原子吸收光譜儀;北京科技大學新金屬國家重點實驗室德國(德國蔡司公司)AURIGACrossBeamFIB/SEM工作站;日本(日本理學公司)D/Max-RB型X射線衍射儀。細菌纖維素膜的純化處理:取細菌纖維素用清水多次沖洗,除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將細菌纖維素浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液,100℃下煮沸60min,洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0.05mol/L的NaOH溶液,80~100℃下煮沸30min,然后用蒸餾水多次沖洗;氧化細菌纖維素的制備:配置濃度為0.08mol/L的高碘酸鈉溶液,將預(yù)處理的細菌纖維素浸泡在上述高碘酸鈉溶液中,避光保存72h,得到氧化率為59.7%的氧化細菌纖維素(DBC)。用去離子水將氧化細菌纖維素膜反復(fù)浸泡沖洗,防止有高碘酸鈉溶液的殘留,之后封裝置于陰涼處保存。氧化細菌纖維素/納米銀復(fù)合材料的制備:配置濃度為0.05mol/L的銀氨溶液,將制備的氧化率為59.7%的氧化細菌纖維素浸入銀氨溶液中常溫保持5,10,15min,之后將反應(yīng)得到的含單質(zhì)納米銀的細菌纖維素膜取出反復(fù)用蒸餾水浸泡沖洗,去除細菌纖維素膜中殘留化學試劑,從而獲得含單質(zhì)納米銀的氧化細菌纖維素膜(AgNPs-DBC)。采用原子吸收法測試AgNPs-DBC復(fù)合材料中的銀含量;場發(fā)射掃描電鏡觀察AgNPs-DBC復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu);X射線衍射考察AgNPs-DBC復(fù)合材料的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和銀的存在形式;用抑菌環(huán)法測試AgNPs-DBC對金黃色葡萄球菌的抑菌效果;采用胎鼠表皮細胞測試AgNPs-DBC復(fù)合材料生物相容性。2結(jié)果與討論2.1反應(yīng)時間對agnps-dbc復(fù)合材料銀含量的影響采用高碘酸鈉選擇性氧化的方法對細菌纖維素材料進行氧化,使得細菌纖維素分子的2,3位C-C鍵斷裂,同時2,3位上的羥基氧化生成醛基,反應(yīng)如式(1)所示。如圖1a所示n,氧化細菌纖維素的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中存在大量的醛基。銀氨溶液中的銀氨絡(luò)合物Ag(NH3)2+可被醛類化合物還原為銀,而醛被氧化為相應(yīng)的羧酸根離子。因此氧化細菌纖維素可與銀氨溶液直接反應(yīng),化學反應(yīng)方程式如式(2)所示。氧化細菌纖維素的醛基被氧化成羧基,生成大量零價銀,這些銀游離于細菌纖維素納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中(圖1b),隨后,銀在水-細菌纖維素的二元體系中結(jié)晶長大形成納米銀顆粒并沉積于細菌纖維素的表面(圖1c)。本研究采用原子吸收法測試了反應(yīng)不同時間制得的AgNPs-DBC復(fù)合材料的銀含量,如表1所示。銀含量測試結(jié)果表明AgNPs-DBC的銀含量在8.18~61.31mg/100cm2范圍內(nèi)。復(fù)合材料的銀含量隨反應(yīng)時間的增加而增大,因此可以通過控制反應(yīng)時間來達到控制AgNPs-DBC銀含量的目的。一般來說,含銀量越高的產(chǎn)品其抗菌性能也越強,而目前臨床使用的含銀醫(yī)用敷料的銀含量在1.6~109mg/100cm2范圍內(nèi)。每100cm2AgNPs-DBC復(fù)合材料的銀含量約為數(shù)十毫克,因此可以預(yù)見AgNPs-DBC有良好的抑菌效果,本實驗下面將會評價AgNPs-DBC復(fù)合材料的抑菌效果。2.2agnps-dbc復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)及粒徑分布圖2a~2e是細菌纖維素和AgNPs-DBC復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu)。細菌纖維素和氧化細菌纖維素的微觀結(jié)構(gòu)都呈現(xiàn)了一個發(fā)達的納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(圖2a),不同的是氧化細菌纖維素的納米纖維發(fā)生彎曲(圖2b)。圖2c~2e分別是反應(yīng)5,10,15min制得的AgNPs-DBC復(fù)合材料的微觀結(jié)構(gòu):反應(yīng)5min制得的AgNPs-DBC中有少量納米銀顆粒生成,納米銀顆粒依附于氧化細菌纖維素的納米纖維生成;反應(yīng)10和15min制得的AgNPs-DBC中有大量納米銀顆粒生成,納米銀顆粒依附于氧化細菌纖維素的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),幾乎覆蓋了整個氧化細菌纖維素的表面。所有樣品中納米銀顆粒均呈現(xiàn)圓球形,不同反應(yīng)時間下納米銀顆粒的粒徑?jīng)]有顯著地差異。采用Image-ProPlusVersion6.0軟件統(tǒng)計了AgNPsDBC復(fù)合材料中納米銀顆粒的粒徑分布情況,如圖2f所示。統(tǒng)計結(jié)果表明,AgNPs-DBC復(fù)合材料中納米銀顆粒粒徑為0~80nm,80%以上的顆粒粒徑分布在20~30nm。上述分析表明,氧化細菌纖維素還原法制備的含納米銀氧化細菌纖維素復(fù)合材料(AgNPs-DBC)中納米銀顆粒有效地結(jié)合到細菌纖維素納米纖維網(wǎng)絡(luò)中,且納米銀顆粒分布均勻。2.3細菌纖維素i型晶體的結(jié)構(gòu)表征BC的XRD圖譜(圖3a)清晰地顯示了3個特征峰,布拉格角為14.60°,16.82°和22.78°,分別對應(yīng)于纖維素的、(110)和(200)晶面,這與Watanabe等人的實驗結(jié)果一致。根據(jù)布拉格定律計算出各晶面的面間距分別為0.606,0.527和0.390nm,這是典型的纖維素I型晶體。圖3b是氧化細菌纖維素的X射線衍射圖譜,也同樣顯示了纖維素I型晶體、(110)和(200)晶面的3個特征峰,與細菌纖維素相比沒有變化。圖3c是AgNPs-DBC的XRD圖譜,圖中同樣顯示了纖維素I型晶體、(110)和(200)晶面的3個特征峰。從圖3c中還可看到在2θ角為38.1°,44.2°,64.2°,77.5°,81.5°處的5個特征峰,它們分別與單質(zhì)銀的(111)、(200)、(220)、(311)、(222)晶面衍射峰相對應(yīng)。單質(zhì)銀的存在,證實了銀氨溶液與含醛基的氧化細菌纖維素反應(yīng)在其納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中生成了單質(zhì)形態(tài)的銀顆粒。單質(zhì)銀顆粒的平均粒度可以使用Scherer公式在各個X射線衍射峰處的半峰寬(FWHM)計算后求平均值得到。計算得到AgNPs-DBC中的單質(zhì)銀顆粒平均粒徑約為21.4nm,結(jié)果與微觀結(jié)構(gòu)分析中軟件統(tǒng)計的結(jié)果相近。2.4agnps-dbc復(fù)合材料的抑菌圈本實驗采用抑菌圈法測定AgNPs-DBC對金黃色葡萄球菌的抗菌性能。抑菌圈法操作簡單,肉眼即可辨認,直觀性好,是一種定性或半定量的方法。為了對比AgNPs-DBC與現(xiàn)有產(chǎn)品的抑菌性能,選用一款市售產(chǎn)品做為陽性對照組,選取反應(yīng)10min制得的AgNPs-DBC復(fù)合材料作為實驗組。每個樣品做8個平行樣(n=8),結(jié)果取其平均值。AgNPs-DBC及對照組樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌圈如圖4所示。AgNPs-DBC對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度為(5.78±1.21)mm(圖4c),而細菌纖維素對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度為零(圖4a)。市售產(chǎn)品對金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)寬度為(3.12±1.07)mm(圖4b),結(jié)果表明納米銀顆粒的加入顯著提高了氧化細菌纖維素的抑菌性能,同時AgNPs-DBC復(fù)合材料的抑菌效果好于對照組市售產(chǎn)品,統(tǒng)計學分析表明2組之間存在顯著性差異(P>0.05)。2.5agnps-dbc復(fù)合材料對表皮細胞增殖的影響本實驗將AgNPs-DBC與胎鼠表皮細胞共培養(yǎng),考察和比較了AgNPs-DBC和陰性對照組對表皮細胞形態(tài)和增殖過程的影響。圖5是AgNPs-DBC復(fù)合材料對胎鼠表皮細胞活性MTT值的影響,數(shù)據(jù)表明與陰性對組相比,AgNPs-DBC復(fù)合材料中表皮細胞的活性MTT值沒有顯著的差異,說明AgNPs-DBC在細胞培養(yǎng)過程中沒有毒性產(chǎn)生。同時不同培養(yǎng)天數(shù)時,細胞的MTT值逐漸增加,表明AgNPs-DBC復(fù)合材料不影響細胞的正常增殖過程。細胞在材料表面增殖的形態(tài)如圖6所示,第4d是陰性對照組和AgNPs-DBC復(fù)合材料組表面的表皮細胞呈透明的小圓球型,這是正常表皮細胞的形態(tài)。同時兩組材料中均有長梭形的成纖維細胞出現(xiàn),這是因為表皮細胞在正常的增殖過程中有向成纖維細胞分化的趨勢,這一結(jié)果表明AgNPs-DBC復(fù)合材料不影響表皮細胞的正常分化過程。第7d時,兩組細胞均布滿整個視野,成纖維細胞匯集成片,細胞增殖旺盛。綜合以上分析,AgNPs-DBC復(fù)合材料不影響胎鼠表皮細胞的正常增殖和向成纖維細胞的分化,具有較好的生物相容性。3agnps-dbc復(fù)合材料的制備方法1)本實驗采用高碘酸鈉將細菌纖維素C6位的羥基氧化成醛基,同時利用醛基化合物與銀氨絡(luò)合物Ag(NH3)2+的反應(yīng),制備了氧化細菌纖維素/納米銀復(fù)合創(chuàng)傷修復(fù)材料(AgNPs-DBC),其中納米銀