核盤菌致病力衰退的分子機(jī)制及防治

核盤菌致病力衰退的分子機(jī)制及防治

核生殖器類和真菌屬（lib.）是世界上的一種常見病，有很廣泛的寄生蟲。一般主要癥狀包括油壓機(jī)、向日葵、大豆和其他油壓機(jī)、十字花科植物、各種蔬菜、中藥等。由核盤菌引起的菌核病造成了作物的大量減產(chǎn)和巨大的經(jīng)濟(jì)損失,如油菜菌核病在我國長江中下游油菜產(chǎn)區(qū)平均發(fā)病率為10%～30%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%,向日葵菌核病在東北華北的向日葵產(chǎn)區(qū)的平均發(fā)病率為30%～60%,嚴(yán)重地塊達(dá)到90%以上甚至絕產(chǎn)。然而菌核病因缺乏野生抗性資源、自然寄主廣泛、病原菌自身抗藥性等原因,在防治上一直存在極大困難。近年來,很多學(xué)者[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10]對不同寄主或不同地域來源的核盤菌菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,雖然不同來源的核盤菌的致病力沒有發(fā)現(xiàn)規(guī)律性的分化,但是核盤菌確實(shí)存在強(qiáng)弱致病型的分化,這表明核盤菌中存在致病力衰退的現(xiàn)象,這種現(xiàn)象已在多種植物病原真菌中報(bào)道過。研究表明,植物病原真菌致病力的衰退與真菌病毒、dsRNA因子、真菌質(zhì)?；蚓€粒體DNA突變等有關(guān)系,真菌的弱毒特性可以通過菌絲融合或無性繁殖的方式在病原菌群體中傳播,這一機(jī)制使其可用于植物病害的生物防治。因此,深入研究核盤菌的致病及弱毒現(xiàn)象機(jī)理可為核盤菌的防治提供新思路。1核仁菌的弱毒現(xiàn)象1.1子囊孢子致病性的變化大多數(shù)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)核盤菌種內(nèi)存在致病性分化的現(xiàn)象。江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所于1979年報(bào)道了不同地區(qū)的油菜菌核病菌的分離株之間有致病力強(qiáng)弱的差別。1990年劉萬仁將采自我國北方和南方農(nóng)作物、蔬菜和中草藥等作物上的60多個(gè)核盤菌菌株進(jìn)行致病性的研究發(fā)現(xiàn),采自北方和南方的分離株生態(tài)型與專化型有差異,它們都包含有致病力強(qiáng)弱不同的菌株,但似乎采自北方的菌株的致病性更強(qiáng)。李國慶等對不同寄主來源和不同地域的核盤菌進(jìn)行研究認(rèn)為,不同核盤菌菌株在油菜上的致病性表現(xiàn)為絕大多數(shù)菌株的致病性很強(qiáng),差異不明顯,沒有質(zhì)的分化。對于地理來源和寄主來源與致病性的關(guān)系,Price和Steadman發(fā)現(xiàn)采自同一寄主的和采自同一地區(qū)的核盤菌菌株間的致病性表現(xiàn)出很大的差異,但是這種差異與菌株的寄主和地理來源的關(guān)系不明顯。劉勇測定了15個(gè)構(gòu)建于4個(gè)不同地區(qū)油菜核盤菌的子囊孢子單孢菌系的致病力,發(fā)現(xiàn)單孢菌系的致病力間存在差異。李永紅研究發(fā)現(xiàn)新疆阿勒泰地區(qū)核盤菌對向日葵的侵染很強(qiáng),但對油菜和大豆的侵染較弱,而在陜西大荔的油菜與大豆、油菜與向日葵的輪作田中發(fā)現(xiàn),核盤菌對油菜和向日葵的侵染很強(qiáng),卻不侵染大豆;李沛利和聶峰杰分別對四川省和陜西省核盤菌的研究證明核盤菌種群內(nèi)有明顯的致病性分化,各地均存在致病力不同的菌株,來自不同寄主的菌株也存在致病力的差異,但是這種差異同地理來源和寄主來源的關(guān)系不明顯。1.2核盤菌的弱毒性1.2.1力學(xué)性能型菌株核盤菌在自然條件下存在弱毒菌株(表1)。Boland1992年首次報(bào)道了在加拿大一份土壤樣品中分離到一株弱致病力菌株91,該菌株在PDA上生長緩慢,菌落小且不規(guī)則擴(kuò)展,萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲的致病力很弱。李國慶1996年報(bào)道了自黑龍江省佳木斯市的一株茄子病殘?bào)w上的菌核中分離獲得弱毒菌株Ep-1PN,其致病力弱且具有可傳染性,是自然衰退的弱毒力菌株。與正常菌株相比,Ep-1PN在PDA上培養(yǎng)生長速度慢,菌落不規(guī)則擴(kuò)展,氣生菌絲發(fā)達(dá),菌核產(chǎn)量較低。Zhang2006年在湖北省孝感市一塊油菜田中分離到一株弱致病力菌株XG36-1,該菌株菌落呈扇形擴(kuò)展,氣生菌絲較豐富,產(chǎn)菌核較少且菌核不規(guī)則排列于菌落。聶峰杰2008年在陜西省油菜病殘?bào)w上分離到兩株無致病力的核盤菌菌株SMX6-1-4和SCG1-1-1及部分弱致病力的菌株。Yu2009年在湖南的一株油菜病殘?bào)w中分離到一株弱致病力分離株DT-8,該菌株在PDA上生長緩慢,菌絲稀疏,色素分布不均,菌核小且形成時(shí)間較長。劉立江等2011年自油菜病殘?bào)w的菌核中分離獲得弱致病力菌株HN-138,該菌株的生長速度、菌落形態(tài)與正常菌株相比沒有顯著差異,呈均勻放射性擴(kuò)展,但是菌絲茂盛、氣生菌絲發(fā)達(dá),不產(chǎn)生菌核。謝甲濤2011年采自發(fā)病大戟莖稈內(nèi)的菌核分離的菌株WF2-1,菌落邊緣呈扇形擴(kuò)展,菌絲分枝密且部分菌絲尖端有原生質(zhì)滲出,對油菜大豆等寄主植物致病力弱。1.2.2來自日本的菌株,其菌株干的培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室采用誘變手段或通過核盤菌繼代培養(yǎng)可能得到致病力弱的突變菌株。Godoy于1990年采用紫外線誘變核盤菌子囊孢子的方法獲得了喪失致病能力的核盤菌后代。李國慶等1993年將來自向日葵上的核盤菌菌株Sun-1P經(jīng)過多次轉(zhuǎn)代培養(yǎng),及冰箱保存后菌株的致病力變?nèi)?產(chǎn)菌核的能力降低,生理特性可能發(fā)生了變異。Huang1981年自加拿大向日葵病殘?bào)w上采集到一株產(chǎn)生褐色菌核的強(qiáng)致病力菌株,經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)轉(zhuǎn)代保存,Li2000年得到該菌株的單子囊孢子有性子代S10,該菌株產(chǎn)生不規(guī)則的菌絲分枝,菌落呈褐色,菌核產(chǎn)量減少,在PDB培養(yǎng)液中的草酸積累量顯著減少,對油菜的致病力明顯減弱。1.3dna病毒核酸研究表明核盤菌中存在多種與弱毒相關(guān)的真菌病毒(表1),包括RNA病毒、單鏈環(huán)狀DNA病毒等,除此之外,還存在部分沒有定性的雙鏈(double-stranded)RNA(dsRNA)因子。1.3.1ssrvvirus目前,在核盤菌中已發(fā)現(xiàn)幾種與核盤菌致病力衰退相關(guān)的RNA病毒。Boland首次在弱毒菌株91中發(fā)現(xiàn)存在雙層膜、70nm大小的真菌病毒,并認(rèn)為其所攜帶的dsRNA因子與菌株弱毒特性相關(guān)。李國慶等從Ep-1PN中分離到3種不同的dsRNA片段,大小分別為1.0kb,6.4kb和7.4kb,其中6.4kb大小的片段與Ep-1PN弱毒性狀緊密伴隨出現(xiàn),研究證實(shí)其為與核盤菌致病力衰退相關(guān)的真菌病毒基因組RNA,命名為SsDRV(S.sclerotiorumdebilitation-associatedRNAvirus)。SsDRV與植物上的Flexiviridea科allexivirus屬病毒以及一種未分類的侵染植物病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的真菌病毒BotrytisvirusF(BVF)有較高的同源性,但是SsDRV因其缺乏外殼蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白而有別于Allexivirus屬植物病毒和BVF。用透射電鏡從Ep-1PN的菌絲和菌核細(xì)胞中沒有觀察到類似病毒粒子的存在,SsDRV也許以裸露的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)。Ep-1PN中分離出的7.4kb的dsRNA片段屬于一種類似于人類戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus)的真菌病毒,特命名該病毒為核盤菌RNA病毒L(S.sclerotiorumRNAvirusL,SsRV-L)。在Ep-1PN的培養(yǎng)物中僅得到3株含有SsRV-L的分離株,發(fā)現(xiàn)3個(gè)分離株的菌落生長速度和致病力都弱于無病毒菌株,但明顯強(qiáng)于Ep-1PN,表明SsRV-L對宿主核盤菌的致病力有影響,但作用較SsDRV要輕微許多。Ep-1PN中分離出的1.0kb大小的片段不能穩(wěn)定出現(xiàn),序列比對發(fā)現(xiàn)其屬于SsDRV的缺陷型dsRNA。1.3.2病毒分離和序列分析以往的研究表明真菌中已發(fā)現(xiàn)的所有真菌病毒均為RNA病毒,甚至有學(xué)者認(rèn)為真菌中可能存在一種可抑制DNA病毒復(fù)制和增殖的特殊機(jī)制。Yu等2009年在湖南的一株油菜病殘?bào)w中分離到一株形態(tài)學(xué)特征與Ep-1PN相似致病力更弱的分離株DT-8,并從中分離出與弱毒相關(guān)的單鏈環(huán)狀DNA病毒(SsHADV-1),首次證實(shí)真菌中存在DNA病毒。SsHADV-1全長2166nt,呈單鏈環(huán)狀,序列分析發(fā)現(xiàn)該病毒結(jié)構(gòu)與雙生病毒科(Geminiviridae)中玉米線條病毒屬(Mastrevirus)的基因結(jié)構(gòu)相似,復(fù)制相關(guān)蛋白與雙生病毒具有較高同源性,病毒粒子為等軸球形顆粒,與雙生病毒粒子兩個(gè)不完整的二十面體的雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)顯著不同。對HN138的研究發(fā)現(xiàn)該菌株感染了2種病毒,一種是與SsHADV-1病毒相同DNA病毒,另外一種是未知的dsRNA病毒。1.3.3核盤菌雙分病毒病毒核酸片段sspv-像從HN138中分離出的dsRNA包括兩個(gè)組分,分別為dsRNA-1和dsRNA-2,全長為6213bp和5878bp。分析表明dsRNA-1與玉蜀黍黑粉病病毒H1(Ustilagomaydisvirus-H1,UmV-H1)具有較高的同源性;dsRNA-2可能是病毒的外殼蛋白(coatprotein,CP)。比較基因組學(xué)分析表明HN138中的dsRNA基因組結(jié)構(gòu)與真菌病毒雙分病毒科(Partitiviridae)類似,但是其基因組顯著大于雙分病毒的基因組,暫時(shí)命名為核盤菌雙分病毒類似病毒(S.sclerotiorumpartitiviruslikevirus1,SsPV-like-1)。序列分析發(fā)現(xiàn)SsPV-like-1僅與隸屬于整體病毒科(Totiviridae)的真菌病毒UmV-H1有較近的親緣關(guān)系。這是首次在核盤菌中發(fā)現(xiàn)有別于雙分病毒的雙節(jié)段病毒。對弱毒株XG36-1研究發(fā)現(xiàn),其中存在與弱毒相關(guān)的真菌病毒,這種真菌病毒很有可能是一種新的病毒,它使XG36-1致病力嚴(yán)重衰退,且具有傳染性。在電鏡下發(fā)現(xiàn)這種病毒粒體的直徑約40nm,數(shù)量稀少,但是未提到其核酸片段。從核盤菌強(qiáng)致病力菌株XG19-2中提取到dsRNA片段,命名為SsXG19-2RV。通過對該dsRNA的克隆,得到了部分cDNA序列,發(fā)現(xiàn)該真菌病毒與DiaportheambiguaRNAvirus1(洋梨干枯病病原菌病毒,DaRV1)有高度的同源性,DaRV1可以使寄主產(chǎn)生弱毒性,而SsXG19-2RV對菌株XG19-2并沒有影響。WF2-1中含有兩條大小分別為2287bp、2274bp的dsRNA(分別命名為dsRNA1和dsRNA2)。研究表明WF2-1中所含有的病毒屬于雙分病毒科的一個(gè)新種,命名為SsPV-1/WF2-1(Sclerotiniasclerotiorumpartitvirus1WF2-1)。2核糖菌弱毒癥的生防潛力2.1真菌病毒和真菌dsrna的傳播途徑檢測真菌病毒的侵染性是目前研究的一個(gè)重要方面,對了解真菌病毒與核盤菌的互作關(guān)系、真菌病毒的復(fù)制過程和作為生物防治工具等有重要的意義。真菌病毒傳播模式一般分為垂直傳播和水平傳播兩種。垂直傳播主要是真菌繁殖時(shí)產(chǎn)生的孢子攜帶病毒進(jìn)行傳播。研究表明真菌無性生殖產(chǎn)生的無性孢子直接來源于菌絲體,病毒攜帶率很高,可通過胞質(zhì)傳播,核盤菌的菌核中能檢測到真菌病毒的存在;真菌的有性孢子傳毒比較少,侵染率較低,大多數(shù)子囊菌亞門的真菌有性子代未發(fā)現(xiàn)真菌病毒或dsRNA。研究表明:Ep-1PN的弱毒特性不能夠穩(wěn)定地傳遞給其有性子代,隨機(jī)測定了30多個(gè)有正常培養(yǎng)性狀的有性子代的致病力表明它們不但恢復(fù)了生長也恢復(fù)了致病作用。對核盤菌弱毒菌株XG36-1的菌核進(jìn)行誘導(dǎo),只有少數(shù)菌核可以萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤,對獲得的104個(gè)子囊孢子單孢分離物進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)全部恢復(fù)了核盤菌的正常培養(yǎng)特性,與XG36-1存在顯著差異(P﹤0.05),從中隨機(jī)挑取的30個(gè)菌株致病力都恢復(fù)了正常。水平傳播目前還沒有發(fā)現(xiàn)自然的體外傳播途徑,僅依賴寄主個(gè)體間菌絲融合擴(kuò)散,但菌絲融合只有在營養(yǎng)體親和型相同的菌株的細(xì)胞間才能進(jìn)行。研究表明:菌株Ep-1PN中的弱毒因子可以在葉面上和土壤中侵染營養(yǎng)體親和型相同的正常菌株,使正常菌株毒力衰退。2.2營養(yǎng)不親和型營養(yǎng)不親和是指兩個(gè)病原菌不能相互融合,菌絲間會組建一個(gè)非自身識別系統(tǒng),通過在不同個(gè)體間形成異核體以阻止真菌病毒、質(zhì)粒等有害遺傳因子的水平轉(zhuǎn)移,從而保護(hù)真菌個(gè)體。核盤菌在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的營養(yǎng)不親和型,對核盤菌菌株進(jìn)行親和性的測定后發(fā)現(xiàn)核盤菌的非親和群大多是由菌株自身親和得到的,而不同菌株間組成親和群的比例很小。因此,如何克服核盤菌復(fù)雜的營養(yǎng)不親和限制,擴(kuò)大弱毒因子對核盤菌種群的影響,成為其用于生物防治的一大難題。2.3病毒粒子防治病害的作用為了打破營養(yǎng)不親和性的限制,實(shí)現(xiàn)真菌病毒粒子在不同寄主之間的轉(zhuǎn)移和繁殖,進(jìn)而達(dá)到防治病害的作用,國內(nèi)外學(xué)者從不同角度,利用不同方法開展了大量的研究。2.3.1營養(yǎng)非親和型菌株姜道宏采用原生質(zhì)體融合技術(shù)把Ep-1PN中的dsRNA轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)體非親和型的菌株中,使后者轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵局?打破了真菌病毒無法在營養(yǎng)非親和的菌株間傳播的限制,為Ep-1PN作為田間生物防治因子提供了可能。但是原生質(zhì)融合技術(shù)也存在一些問題,如融合子的營養(yǎng)親和型發(fā)生變化有可能成為與兩個(gè)親本都不一樣的營養(yǎng)親和型;原生質(zhì)體再生后代中有較高頻率的恢復(fù)毒力的菌株。2.3.2sdrv在營養(yǎng)不親和性菌株間的轉(zhuǎn)染Yu等將DT-1與攜帶潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的營養(yǎng)不親和核盤菌菌株Ep-1PNA367對峙培養(yǎng),10d后挑取接觸區(qū)菌絲于含潮霉素的培養(yǎng)基上篩選,結(jié)果表明,約30%能在選擇性培養(yǎng)基上生長的菌落表現(xiàn)弱毒特性,提取DNA測定發(fā)現(xiàn),表現(xiàn)出弱毒特性的Ep-1PNA367分離物均含有SsHADV-1的基因組DNA,從而證明了SsHADV-1可在營養(yǎng)不親和性菌株間水平傳播。采用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化核盤菌原生質(zhì)體的方法,將從弱毒菌株DT-8菌絲體中直接提取的病毒DNA(含雙鏈和單鏈)、純化的SsHADV-1病毒粒體和從病毒粒體裂解得到的ssDNA分別轉(zhuǎn)染強(qiáng)毒菌株Ep-1PNA367,試驗(yàn)證明病毒轉(zhuǎn)染成功,且不同轉(zhuǎn)染子在是否攜帶病毒亞基因及其亞基因組的大小上存在差異。盾殼霉(Coniothyriumminitans)作為核盤菌的重要的寄生菌,能寄生三葉草核盤菌(S.trifoliorum)、小核盤菌(S.minor)和洋蔥小核菌(S.cepivorum)等近緣真菌,因此將SsDRV的全長cDNA通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入盾殼霉核染色體上也極有可能獲得具傳染活性的SsDRV。攜帶具有傳染活性的SsDRV的盾殼霉工程菌株將在很大程度上擴(kuò)大對核盤菌及其近緣真菌的生物防治范圍。2.3.3基于生物酶的公司基因文件cdna的轉(zhuǎn)化核盤菌種內(nèi)營養(yǎng)不親和能阻止真菌病毒的傳播,但是有證據(jù)表明,有些真菌病毒可以在非營養(yǎng)親和型的菌株間甚至不同的屬間進(jìn)行低概率的傳播,從一種寄主擴(kuò)散至另外一種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的寄主。來自核盤菌弱毒株Ss27的dsRNA在室內(nèi)可以通過對峙培養(yǎng)轉(zhuǎn)染給小核盤菌(S.mino