陰道念珠菌感染致病菌種及抗真菌藥物耐藥譜研究

陰道念珠菌感染致病菌種及抗真菌藥物耐藥譜研究

細(xì)菌是人體的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)。如果身體的免疫能力降低，可能會(huì)導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染，這通常是一些嚴(yán)重患者的直接原因。本文以婦產(chǎn)科常見(jiàn)病———念珠菌陰道炎（VVC）的致病原為研究對(duì)象，從臨床分離培養(yǎng)鑒定菌株589株，對(duì)其菌種分類、藥敏結(jié)果進(jìn)行分析，并結(jié)合耐藥基因分型研究，從臨床、細(xì)胞、分子三個(gè)水平探討念珠菌的致病與耐藥現(xiàn)象以及流行病學(xué)特征，希望不僅能對(duì)念珠菌陰道炎的治療有幫助，而且能對(duì)機(jī)體其它部位念珠菌病的臨床治療提供借鑒。1數(shù)據(jù)和方法1.1病例選擇及用藥史收集2002年6月～2003年2月在本院門(mén)診就診的VVC患者589例，年齡19～51歲，均為再發(fā)病例，即本次發(fā)病時(shí)間距前次患病達(dá)3個(gè)月以上，定義為再發(fā)患者。詳細(xì)詢問(wèn)患者既往患VVC時(shí)間及用藥史，患者病程3月～20年，平均2.5年。其中用過(guò)唑類藥者551例（93.6%）。取患者的陰道分泌物，鏡下找到孢子或菌絲，分離念珠菌作進(jìn)一步鑒定。1.2細(xì)菌的分離和鑒定將標(biāo)本接種于沙氏培養(yǎng)基，37℃孵育24～48h，分純后用VITEK32的酵母菌鑒定卡（YBC）鑒定菌種。1.3藥物過(guò)敏試驗(yàn)5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑、酮康唑的敏感性測(cè)試采用ATBFUNGUS試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)操作。1.4通過(guò)機(jī)械pcr方法確定白色念菌的基因型1.4.1提取的細(xì)菌dna1.4.2gtagcgk-raERIC引物ERICΙ(CAT-GTAAGCTCCTGGGGATTCAC)、ERICⅡ(AAGTA-AGTGACTGGGGTGGAGCG)，由上海生工合成。50μl反應(yīng)體系中含5mMMgCl2、0.2mMdNTP、2.5uTaq酶、2μl模板（0.05～2μg）、ERICΙ2μM、ERICⅡ2μM。擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性5min;94°C40s,40°C1min,72°C1min循環(huán)35次。每菌株用兩種模板濃度及兩個(gè)以上的PCR反應(yīng)以證實(shí)ERIC-PCR的可重復(fù)性。1.4.3bio-rad透射檢測(cè)將臨床白色念珠菌ERIC-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各取10μl加樣于2%瓊脂糖凝膠，在80V恒壓下電泳1h，溴乙錠染色。用BIO-RAD透射式紫外分析儀分析結(jié)果。白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC90028及近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC22019基因型分析作對(duì)照。1.4.4具有白凈菌酶活性物質(zhì)的敏感植物與抗炎菌群落的ri-pcr基因型之間的比較將147株白色念珠菌咪康唑敏感株及60株耐藥株同法行ERIC-PCR擴(kuò)增，比較兩組基因型種類。1.5統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果2.1種鑒定結(jié)果585例的陰道分泌物分離出念珠菌589株，其中4例分離出2種念珠菌。經(jīng)菌種鑒定共有6種菌株，其中白色念珠菌487株，占總數(shù)82.7%；光滑念珠菌75株，占12.7%；熱帶念珠菌18株，占3.0%；近平滑念珠菌7株，占1.2%；克柔念珠菌及郎可比念珠菌各有1株，各占0.2%。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。2.2對(duì)酮康唑、咪康唑和益康唑的耐藥率兩組的耐藥譜顯著不同，從表1可見(jiàn)，與白色念珠菌相比，非白色念珠菌對(duì)酮康唑、咪康唑與益康唑的耐藥率高（P<0.01）；白色念珠菌則對(duì)5-氟胞嘧啶較多耐藥(P<0.01)。2.3酮康唑耐藥情況念珠菌對(duì)唑類存在明顯交叉耐藥現(xiàn)象，72株益康唑耐藥的念珠菌中有68株（94.9%）同時(shí)對(duì)酮康唑耐藥，69株（95.80%）對(duì)咪康唑耐藥；80株酮康唑耐藥的念珠菌中，79株（98.26%）對(duì)益康唑耐藥，77株（96.52%）對(duì)咪康唑耐藥；79株咪康唑耐藥的念珠菌中有69株（87.69%）對(duì)益康唑耐藥，67株（85.38%）對(duì)酮康唑耐藥。2.4不同菌株的認(rèn)證指紋和細(xì)胞條帶瓊脂糖電泳凝膠分析顯示，ERIC-PCR指紋具有良好的穩(wěn)定性，同一菌株一定擴(kuò)增條件下不同模板濃度的擴(kuò)增帶型一致；近平滑念珠菌ATCC22019的ERIC-PCR指紋與白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC90028及其它白色念珠菌實(shí)驗(yàn)菌有明顯差異；白色念珠菌菌株間有一些共同的特征性條帶，如300～400bp間的二聯(lián)帶及100bp、150bp處的條帶；但白色念珠菌菌種內(nèi)不同菌株間仍存在差異條帶;在147株白色念珠菌咪康唑敏感菌株與60株咪康唑耐藥菌株的ERIC-PCR指紋比較中發(fā)現(xiàn)，兩組基因型種類一致，未發(fā)現(xiàn)咪康唑耐藥株特征性帶譜。3菌株分子特征的新探討隨著抗真菌藥物在臨床的廣泛應(yīng)用，致病菌譜改變的報(bào)道也日漸增多。1990年以來(lái)，各類調(diào)查發(fā)現(xiàn)非白色念珠菌感染有上升趨勢(shì)，國(guó)外資料報(bào)道VVC中白色念珠菌占85%～90%，而光滑念珠菌占5%～10%，熱帶念珠菌占5%。本研究對(duì)再發(fā)性VVC患者致病菌種統(tǒng)計(jì)表明，所檢出的念珠菌仍以白色念珠菌為主，達(dá)82.7%，而非白色念珠菌中則以光滑念珠菌占多數(shù)，達(dá)12.7%。在再發(fā)病例中光滑念珠菌感染的比例較高,提示光滑念珠菌引起的陰道炎可能較為難治，其原因可能與光滑念珠菌對(duì)最常用抗真菌藥唑類的內(nèi)在耐藥性較高有關(guān)。因而臨床對(duì)再發(fā)性VVC患者應(yīng)注意鑒定致病菌種，給予針對(duì)性的治療。在我們的統(tǒng)計(jì)中還發(fā)現(xiàn)，念珠菌對(duì)益康唑、酮康唑、咪康唑三種唑類藥物有很高的交叉耐藥性。這說(shuō)明在臨床抗真菌治療中，若對(duì)上述三種唑類藥物之一存在耐藥，不宜再用另兩種藥物。5-氟胞嘧啶大多用于治療深部真菌感染，極少用于VVC病例，在本研究中發(fā)現(xiàn)白色念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶耐藥率高達(dá)38.1%，說(shuō)明白色念珠菌對(duì)5-氟胞嘧啶的原發(fā)性耐藥率較高，在深部感染治療時(shí)應(yīng)注意配伍使用其它藥物。兩性霉素B也主要用于深部真菌感染治療，本統(tǒng)計(jì)中兩性霉素B耐藥率低，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。制霉菌素的應(yīng)用應(yīng)引起重視，該藥物屬于多烯類抗生素，廣譜抗真菌機(jī)理同兩性霉素B，從本文結(jié)果看念珠菌極少對(duì)制霉菌素耐藥，似乎更應(yīng)受到臨床青睞。念珠菌耐藥株與敏感株之間內(nèi)在的分子基礎(chǔ)的聯(lián)系一直受到關(guān)注。本研究采用ERIC-PCR基因分型方法以最常見(jiàn)的白色念珠菌咪康唑耐藥株、敏感株為對(duì)象在基因組水平對(duì)此作了探討。所采用的ERIC引物序列是許多細(xì)菌基因組中的共有序列，真菌基因組中并不存在，ERIC-PCR因而實(shí)質(zhì)上是一種隨機(jī)擴(kuò)增PCR(RAPD-PCR)。Taksuka等比較了從艾滋病人口腔中分離的氟康唑耐藥株的形態(tài)、核型及DNA分型，發(fā)現(xiàn)ERIC-PCR能夠區(qū)分種以下的分離株，其區(qū)別水準(zhǔn)相當(dāng)于脈沖場(chǎng)凝膠電泳。本試驗(yàn)用這種方法對(duì)白色念珠菌進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)白色念珠菌菌株間有一些共同的特征性條帶，但不同菌株之間仍有差異，證實(shí)了ERIC-PCR基因分型方法具有區(qū)分種內(nèi)亞株的敏感性，提示在臨床實(shí)踐中有可能作為菌株分型分株的方法之一。關(guān)于耐藥株與敏感株相比無(wú)特征性的DNA指紋改變，其他研究者也有類似結(jié)論，其原因可能是由于白色念珠菌對(duì)唑類的耐藥主要是繼發(fā)性的，部分耐藥發(fā)生是由于基因的表達(dá)差異；這也從另一角度說(shuō)明了基因型的相對(duì)穩(wěn)定性及其在流行病學(xué)調(diào)查中的價(jià)值。ERIC-PCR基因分型方法雖不能作為耐藥診斷的依據(jù)，但因其能區(qū)分種內(nèi)亞株而有助于鑒定臨床耐藥菌株的敏感親本