兜蘭的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

兜蘭的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

與大多數(shù)蘭花一樣，paphiopedima的種子沒有胚胎。它們?cè)谧匀画h(huán)境中必須與真菌共生，發(fā)芽率很低。蘭花的傳統(tǒng)繁殖方式為分株繁殖,繁殖系數(shù)低、速度慢,難以滿足保護(hù)和開發(fā)的要求。蘭花的組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代,Morel(1960)采用大花蕙蘭的莖尖為外植體,誘導(dǎo)形成類原球莖并分化植株,為實(shí)現(xiàn)蘭花的工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。之后組培在其它許多蘭花上獲得了成功(Arditti&Ernst,1993;范成明等,2003)。但兜蘭人工授粉結(jié)實(shí)率低,其無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)難度大,是蘭科植物中種子試管培養(yǎng)最困難的屬之一。本文綜述了兜蘭的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展,并展望了其應(yīng)用前景,以期對(duì)兜蘭屬植物的資源保護(hù)和商業(yè)應(yīng)用提供參考。1生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑兜蘭的無(wú)菌播種一般不需添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,萌發(fā)的原球莖能發(fā)育成小苗,在添加合適濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)能進(jìn)行原球莖的增殖,然后再分化成苗。兜蘭果莢的消毒通常用自來(lái)水洗凈,70%酒精表面消毒30s,再以0.1%的升汞溶液消毒15min,最后用無(wú)菌水沖洗5次,用無(wú)菌濾紙吸干水分,用解剖刀切開果莢,將種子散落到培養(yǎng)基中培養(yǎng)(曾宋君等,2006)。1.1種子萌發(fā)率不同兜蘭品種的結(jié)實(shí)率和萌發(fā)率不同,總的說(shuō)來(lái),雜交種的萌發(fā)比原生種容易。杏黃兜蘭(Paphiopedilumarmeniacum)授粉后120d的種子在各供試培養(yǎng)基上較硬葉兜蘭(P.micranthum)的萌發(fā)率低(陳之林等,2004)。帶葉兜蘭(P.hirsutissimums)授粉后150d左右的種子萌發(fā)率可達(dá)50%(曾宋君等,2006)。P.delenatii的萌發(fā)率可達(dá)68%,P.bellatulum可達(dá)69.7%;而菲律賓兜蘭(P.philippinense)的萌發(fā)率僅為32.8%(Li&Li,1999)。1.2種子萌發(fā)的影響不同栽培條件下果莢的成熟時(shí)間可能有一定的差異。果莢采收的時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)有重要的影響。通過(guò)對(duì)杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的播種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)授粉后120d的種子可萌發(fā),而180d時(shí)果莢已近開裂,種子為黑色,在試驗(yàn)中沒有萌發(fā),這可能與完全成熟的種子進(jìn)入休眠期或產(chǎn)生某些抑制物質(zhì)有關(guān)(陳之林等,2004)。有些成熟的種子在休眠時(shí)要培養(yǎng)數(shù)年才能萌發(fā)。有些兜蘭種子在果莢還是青色時(shí)就有可能進(jìn)入了休眠。P.primulimum在授粉后110d,P.delenatii在150d,菲律賓兜蘭和P.bellatulum在130d時(shí)萌發(fā)率最高(Li&Li,1999)。1.3暗培養(yǎng)的影響不同的兜蘭品種對(duì)光照的要求不一樣,有些兜蘭種子必須先經(jīng)歷暗培養(yǎng)才能萌發(fā),有些兜蘭種子不需要暗培養(yǎng)就能萌發(fā)。Stimart和Ascher(1981)報(bào)道暗培養(yǎng)有利于兜蘭種子的萌發(fā)以及幼苗早期的生長(zhǎng)。杏黃兜蘭和硬葉兜蘭經(jīng)歷3周的暗培養(yǎng)有利于提高萌發(fā)率(陳之林等,2004)。1.4thomaleg、杏黃兜底蘭和硬葉中心培養(yǎng)基的萌發(fā)率兜蘭種子萌發(fā)使用的基本培養(yǎng)基有RE(Arditti,1982),MS(Murashige&Skoog,1962),1/2MS,1/4MS,KC(Knudson,1946),VW(Vacin&Went,1949),ThomaleGD和花寶(Hyponex)1號(hào)3g·L-1(Li&Li,1999)等。硬葉兜蘭和杏黃兜蘭在RE培養(yǎng)基上萌發(fā)率分別為32.4%和25.2%,帶葉兜蘭可達(dá)50%;在MS培養(yǎng)基上,硬葉兜蘭僅有極少種子萌發(fā),而杏黃兜蘭沒有萌發(fā),采用1/4MS培養(yǎng)基它們的萌發(fā)率分別為11.0%和8.1%(陳之林等,2004;曾宋君等,2006)。在ThomaleGD培養(yǎng)基上,P.delenatii和P.primulimum的萌發(fā)率均比在其它培養(yǎng)基上高(Li&Li,1999)?？梢娕囵B(yǎng)基的鹽分組成和濃度是影響種子萌發(fā)的重要因素。液體培養(yǎng)對(duì)兜蘭P.bellatulum,P.delenatii,P.primulimum的種子萌發(fā)均表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用(Li&Li,1999)。1.5活性物質(zhì)對(duì)帶葉兜底蘭種子萌發(fā)的影響一般認(rèn)為,在植物胚培養(yǎng)中加入適量的椰乳對(duì)種子的萌發(fā)有利,在杏黃兜蘭和硬葉兜蘭的無(wú)菌播種中,椰乳對(duì)種子的萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用,試驗(yàn)用的椰乳最適濃度為200mL·L-1,但在后期成苗時(shí)會(huì)產(chǎn)生一胚多苗現(xiàn)象,部分苗生長(zhǎng)不正常,這可能與椰乳中富含玉米素(Zeatin)等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有關(guān)。胰蛋白胨和酵母提取物對(duì)杏黃兜蘭和硬葉兜蘭種子的萌發(fā)沒有顯著的影響,但有利于苗的生長(zhǎng)(陳之林等,2004)。培養(yǎng)基中加入活性炭一般會(huì)抑制兜蘭種子的萌發(fā)。帶葉兜蘭的組織培養(yǎng)中,在RE培養(yǎng)基中加入活性炭,萌發(fā)率由50%降為45%,但種子出芽后生長(zhǎng)較快(曾宋君等,2006)。而P.bellatulum無(wú)菌播種時(shí)附加活性炭則可提高其萌發(fā)率(Li&Li,1999)。1.6香蕉汁的增殖和分化成苗由種子而來(lái)的原球莖在RE培養(yǎng)基或花寶1號(hào)1.5g·L-1+花寶2號(hào)1.5g·L-1培養(yǎng)基中附加椰乳200mL·L-1、6-BA2.0mg·L-1、NAA0.2mg·L-1和活性炭2g·L-1時(shí),增殖和分化成苗效果均較好,沒加入活性炭,形成的芽有部分會(huì)玻璃化(曾宋君等,2006)。將原球莖分化而來(lái)的小苗分成單株后轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基RE上,生根率均可達(dá)95%以上。添加香蕉汁時(shí),植株生長(zhǎng)較快,根系較好;采用花寶1號(hào)1g·L-1+花寶2號(hào)1g·L-1+蛋白胨2g·L-1+NAA1.0mg·L-1+活性炭2g·L-1+10%香蕉汁,效果好且成本較低,可以在生產(chǎn)中使用(陳之林等,2004;曾宋君等,2006)。2組織培訓(xùn)2.1植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用兜蘭組織培養(yǎng)過(guò)程中,外植體的滅菌難度大。采用莖尖作外植體時(shí),即使通過(guò)常規(guī)消毒仍大量地被細(xì)菌、真菌、病毒和其它病原菌感染(Stewart&Button,1975;Huang,1988),采用2~3mm的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)為外植體,能有效提高消毒的成功率,但由于外植體過(guò)小,外植體的啟動(dòng)生長(zhǎng)速度慢(Stewart&Button,1975)。Huang(1988)利用P.philippinense×P.SusanBooth等雜種兜蘭種子無(wú)菌播種所獲無(wú)菌苗的莖尖為外植體誘導(dǎo)出了叢生芽并能直接成苗。Chen等(2004)利用菲律賓兜蘭(P.philippinense)的雜交種PH59、PH60的葉片為外植體誘導(dǎo)出了不定芽和帶根的小植株。采用未切割的1.5cm完整葉和0.5cm的葉片切塊為外植體時(shí),其不定芽誘導(dǎo)率和出芽個(gè)數(shù)與外植體形式、培養(yǎng)方式、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及兜蘭品種有關(guān)。葉片未切割時(shí),在1/2MS培養(yǎng)基上PH59、PH60均有25%的外植體分化出芽,添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí),1.0mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1TDZ能促進(jìn)PH59不定芽的形成,1.0mg·L-12,4-D,5.0mg·L-1TDZ,1.0mg·L-12,4-D+1.0mg·L-1TDZ能促進(jìn)PH60不定芽的生成。而葉片切割時(shí),PH60只在1/2MS+1.0mg·L-12,4-D+0.1mg·L-1TDZ誘導(dǎo)出了叢生芽,其它所有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其組合均表現(xiàn)出一定的抑制作用;而PH59在TDZ1.0mg·L-1時(shí)盡管出芽的葉片數(shù)減少,但每個(gè)葉片的平均出芽數(shù)增多,可達(dá)7.0個(gè),對(duì)照為5.6個(gè)。2.2,4-d誘導(dǎo)誘導(dǎo)愈傷組織增殖兜蘭雜種P.callosum‘Oakhi’×P.lawrenceanum‘Tradition’由種子萌發(fā)而來(lái)的原球莖在1/2MS+1.0~10mg·L-12,4-D+0.1~1.0mg·L-1TDZ培養(yǎng)基上能形成愈傷組織,單獨(dú)使用TDZ未能誘導(dǎo)出愈傷組織,單獨(dú)使用2,4-D時(shí)誘導(dǎo)率低。愈傷組織在1/2MS+5mg·L-12,4-D+1mg·L-1TDZ培養(yǎng)基上能增殖,增長(zhǎng)倍率可達(dá)2.24。愈傷組織在1/2MS+0.1mg·L-1NAA+0.5mg·L-1TDZ上能形成類原球莖分化出再生芽形成完整株(Linetal.,2000)。2.3培養(yǎng)基和給藥對(duì)奏張水平檢測(cè)活性的影響目前兜蘭不定芽誘導(dǎo)常使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要是生長(zhǎng)素類(如2,4-D和NAA)和細(xì)胞分裂素類(如BA、ZT和KT)。兜蘭雜交種莖節(jié)培養(yǎng)時(shí),在無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的1/2MS培養(yǎng)基上,PH59有33.3%形成了芽,而PH60無(wú)不定芽生成(Chenetal.,2002)。兜蘭雜交種莖節(jié)在初代培養(yǎng)時(shí),BA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)和生根的影響不大,在繼代增殖中,3、9、27、100mg·L-1的BA對(duì)芽的增殖表現(xiàn)出抑制作用,對(duì)根的誘導(dǎo)除低濃度的BA(3mg·L-1)在第2代時(shí)表現(xiàn)出促進(jìn)作用外,其余濃度和代數(shù)中均表現(xiàn)出抑制作用(Huangetal.,2001)。TDZ(0.003、0.03、0.3mg·L-1)在初代培養(yǎng)時(shí)對(duì)不定芽的增殖和生根沒有明顯影響,但繼代培養(yǎng)時(shí)則對(duì)不定芽誘導(dǎo)表現(xiàn)出抑制作用,濃度越高,抑制作用越強(qiáng);除在第3代時(shí)低濃度的TDZ(0.003mg·L-1)可明顯促進(jìn)生根外,TDZ多表現(xiàn)為抑制生根,濃度越高,抑制作用越強(qiáng)(Huangetal.,2001)。雜種PH60在TDZ0.1mg·L-1時(shí)能獲得較高的不定芽誘導(dǎo)率(Chenetal.,2002)。NAA對(duì)不定芽的生長(zhǎng)影響不大,但較高濃度(>1.0mg·L-1)對(duì)不定芽的生成有輕微抑制作用;對(duì)根的誘導(dǎo),較高濃度0.3和1.0mg·L-1比較低濃度0.03mg·L-1效果好(Huangetal.,2001)。2,4-D對(duì)兜蘭莖節(jié)不定芽的誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用,其濃度以1.0mg·L-1時(shí)效果較好;PH59在1/2MS培養(yǎng)基上附加1.0mg·L-12,4-D和0.1mg·L-1NAA組合時(shí)效果比單獨(dú)使用1.0mg·L-12,4-D或0.1mg·L-1NAA好(Chenetal.,2002)。另外,在培養(yǎng)基中加入一定濃度的硫酸腺嘌呤和磷酸二氫鈉對(duì)不定芽的誘導(dǎo)和不定根的生成有一定的促進(jìn)作用(Huangetal.,2001)。糖類物質(zhì)作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,對(duì)原球莖的生長(zhǎng)影響較大。在兜蘭的組織培養(yǎng)中,蔗糖的效果比麥芽糖好,濃度以30g·L-1的效果最好(Huangetal.,2001)。在有機(jī)添加物中,150mL·L-1的椰乳能較好地促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)和不定根的形成。1g·L-1的水解酪蛋白具有相同的效果。10g·L-1的土豆汁能促進(jìn)不定芽的生長(zhǎng),但對(duì)不定根的誘導(dǎo)影響不大,香蕉粉能促進(jìn)不定芽的形成,20g·L-1的效果最好,但對(duì)生根起抑制作用,特別是在高濃度40和60g·L-1時(shí)非常明顯(Huangetal.,2001)。3石混合基質(zhì)中硬葉兜底蘭和杏黃等3種多環(huán)芳烴的生長(zhǎng)兜蘭在出瓶前一般要在栽培溫室中煉苗2周,然后栽培在碎磚塊和火山石混合基質(zhì)或樹皮和火山石的混合基質(zhì)中,保持較高的空氣濕度,硬葉兜蘭和杏黃兜蘭成活率可達(dá)70%以上(陳之林等,2004)。帶葉兜蘭可達(dá)75%以上(曾宋君等,2006)。而Chen等(2002,2004)利用泥炭蘚做基質(zhì),試管苗的成活率高,最高時(shí)可達(dá)100%。4發(fā)展環(huán)保型菌株生產(chǎn)兜蘭由于具有極高的觀賞價(jià)值和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在歐美廣受人們歡迎,其商業(yè)生產(chǎn)目