抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的生態(tài)安全性分析

抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的生態(tài)安全性分析

水稻是中國的主要糧食，65%的人口主要是水稻（張秀福等，2005）。水稻害蟲是制約我國水稻生產(chǎn)的重要生物因子,每年給水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重損失。據(jù)統(tǒng)計,僅水稻螟蟲每年造成的損失就達我國稻谷總產(chǎn)量的3.1%,約63億公斤(盛承發(fā)等2003)?？瓜x轉(zhuǎn)基因水稻的培育和利用為水稻害蟲控制提供了一條最為有效、經(jīng)濟的途徑。然而,目前人們對轉(zhuǎn)基因水稻的安全性尚存在爭議,是轉(zhuǎn)基因水稻尚未能實現(xiàn)大規(guī)模商品化生產(chǎn)的關(guān)鍵原因之一。本文擬在概述抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的研發(fā)現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上,從研究和評價方法、對不同類型非靶標(biāo)生物的影響效應(yīng)等方面就抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對非靶標(biāo)生物安全性的研究進展進行綜述。1抗蟲基因ph抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻是以提高水稻品種對害蟲抗性為目的而培育的一類轉(zhuǎn)基因水稻。自1989年首例抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化成功(楊虹等1989)以來,已獲得了大量的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻,所用的外源基因主要有蘇云金桿菌(BacillusthuringiensisBerliner簡稱Bt)殺蟲蛋白基因(晶體蛋白基因cry和營養(yǎng)期殺蟲蛋白基因vip)、蛋白酶抑制劑基因(如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI或修飾的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因sck、馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因pinII和大豆胰蛋白酶抑制劑基因SbTI)和凝集素基因(如雪花蓮凝集素基因GNA),其中前兩類以二化螟、三化螟、大螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲為靶標(biāo),GNA則以褐飛虱等半翅目害蟲為靶標(biāo)。目前,cry基因是使用最廣泛的抗蟲基因,源于一種革蘭氏陽性土壤芽胞桿菌——蘇云金桿菌(BthuringiensisBerliner),表達Cry殺蟲蛋白。Cry蛋白的殺蟲機理是:被靶標(biāo)昆蟲取食后在中腸堿性環(huán)境中活化,并與昆蟲受體蛋白結(jié)合,引起細胞膜穿孔,破壞細胞滲透平衡,導(dǎo)致細胞腫脹破裂、昆蟲癱瘓或死亡。由于Cry蛋白只能特異地與靶昆蟲中腸上皮細胞的受體蛋白結(jié)合,非靶標(biāo)生物無此類特異受體,因此Cry蛋白對靶標(biāo)害蟲有高毒力而對非靶標(biāo)昆蟲低毒,對人和高等動物無毒。實際上,Bt殺蟲劑作為害蟲的生防制劑應(yīng)用已有百余年歷史,是迄今使用最早、最成功的生物殺蟲劑,其對自然環(huán)境及人類的安全性經(jīng)受了時間的檢驗。目前研發(fā)的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻中,多數(shù)為單價轉(zhuǎn)基因水稻,所用的外源抗蟲基因有cry1Aa、cry-1Ab、cry1Ac、cry1B、cry1C*、cry1Ca1、cry2A、cry9C和CpTI(sck);少數(shù)則導(dǎo)入雙價抗蟲基因或2個抗蟲基因的融合基因,如cry1Ac+cry2A、cry1Ac+CpTI(sck)、cry1Ab+cry2Ab和cry1Ab/cry-1Ac、cry1Ab/cry1B、cry1Ab/vip3H等(Chen等2010,2011;陳洋等2011)。雙價或多價轉(zhuǎn)基因水稻還可通過2個或以上不同單價轉(zhuǎn)基因水稻進行常規(guī)雜交獲得。如,轉(zhuǎn)cry1Ab+cry1C、cry1Ab+cry2A、cry1Ac+cry1C、cry1Ac+cry2A或cry1C+cry2A雙價基因的抗蟲水稻‘明恢63’(Yang等2011)。研究表明,上述轉(zhuǎn)基因水稻對一種或多種鱗翅目靶標(biāo)害蟲表現(xiàn)為較高抗性(Chen等2010,2011),但不抗另一類水稻主要害蟲——稻飛虱。抗稻飛虱轉(zhuǎn)基因水稻因缺乏高效基因而發(fā)展緩慢,已報道的轉(zhuǎn)GNA基因水稻可顯著提高對褐飛虱的抗性,但一般難以達到高抗水平(唐克軒等2001;左示敏等2004),尚待進一步突破。迄今,我國已有一批高抗鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因水稻相繼進入環(huán)境釋放或生產(chǎn)性試驗,并開展了大量相關(guān)的環(huán)境安全性研究,主要有:轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因的‘華恢1號’和Bt‘汕優(yōu)63’,轉(zhuǎn)cry1Ab基因的克螟稻及其衍生品系,轉(zhuǎn)cry1Ac+CpTI(sck)基因的MSA、MSB和‘科豐6號’等,其中,‘華恢1號’和Bt‘汕優(yōu)63’于2009年獲得了我國迄今頒發(fā)的轉(zhuǎn)基因水稻中僅有的2例轉(zhuǎn)基因生物安全證書。2評價原則及評價標(biāo)準(zhǔn)按轉(zhuǎn)基因生物安全性評價的原則,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對非靶標(biāo)生物的影響采用個案評價的原則,即需對每一種轉(zhuǎn)基因水稻進行評價。有關(guān)研究和評價的程序、方法與對象分述如下。2.1非靶標(biāo)生物的安全性評價抗蟲轉(zhuǎn)基因生物對非靶標(biāo)生物的影響風(fēng)險取決于非靶標(biāo)生物接觸或暴露于殺蟲蛋白的概率及接觸或暴露后的危害性,即:風(fēng)險=f(暴露率,危害性)。基于不同暴露水平對非靶標(biāo)生物潛在影響的層次遞進的風(fēng)險評價程序(TieredRiskAssessmentApproach),是目前國際上普遍采用的對轉(zhuǎn)基因生物非靶標(biāo)生物生態(tài)風(fēng)險評價方法,包括室內(nèi)、室內(nèi)擴展、半田間、田間等4個不同層次的實驗研究和評價,與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物的評價體系相似,能嚴(yán)格、有效地評價非靶標(biāo)生物的安全性(Touart和Maciorowski1997;Milofsky2006Romeis等2006,2008;葉恭銀等2011)。(1)第1層次——室內(nèi)實驗:在實驗室條件下通過飼喂添加了數(shù)倍(如10倍)于環(huán)境暴露量的殺蟲蛋白的人工飼料,可在較短時間內(nèi)(如30d)檢測對代表性非靶標(biāo)生物的急性毒性作用。(2)第2層次——室內(nèi)擴展實驗:在實驗室條件下,通過飼喂轉(zhuǎn)基因植物材料或混入轉(zhuǎn)基因材料的人工飼料進行檢測,其暴露劑量一般相當(dāng)于轉(zhuǎn)基因生物目標(biāo)基因的表達量。(3)第3層次——半田間實驗:在溫室或網(wǎng)室條件下,用轉(zhuǎn)基因植物進行較長時間(如一個完整的生命周期)的檢測。暴露劑量接近田間自然狀況暴露時間長于第2層次。(4)第4層次——田間實驗:在田間自然條件下進行的研究,一般通過多地點多年檢測轉(zhuǎn)基因植物對非靶標(biāo)生物的影響。暴露劑量為田間自然水平,暴露時間一般長于前述各層次。上述不同層次實驗中,研究的成本一般隨層次上升而遞增。因此,基于經(jīng)濟有效原則,非靶標(biāo)安全性的研究通常從第1層次開始,當(dāng)前一層次檢測發(fā)現(xiàn)無危害時,可終止后續(xù)實驗做出評價;若前一層次實驗發(fā)現(xiàn)有潛在危害,則繼續(xù)進入下一層次的研究,直至最終可以做出安全性評價的判定。但在實際工作中,因考慮到社會公眾關(guān)注等方面因素,不管前面幾個層次的結(jié)果如何,通常均進行田間實驗,可檢測田間自然生態(tài)條件下的非預(yù)期效應(yīng)。此外,一些研究者認(rèn)為,因田間實驗一般都會進行,半田間實驗可作為可選項。不過也有研究者認(rèn)為田間實驗結(jié)果常因地點、時間的不同而產(chǎn)生較大差異,半田間實驗具有明顯優(yōu)點,如其條件相對可控、暴露量更有保證、結(jié)果更可靠、與實驗室檢測結(jié)果的關(guān)聯(lián)度可能更大。在轉(zhuǎn)基因水稻對非靶標(biāo)生物的影響評價中因僅少部分非靶標(biāo)生物有合適的人工飼料,第1層次的室內(nèi)研究受到限制,因此常以第2層次的室內(nèi)擴展實驗開展較多;同時因水稻的重要性及受公眾的高關(guān)注度,第4層次的田間實驗亦得到廣泛開展(參見后文)。2.2抗蟲認(rèn)識及對非靶標(biāo)害蟲的影響因素稻田生物種類繁多,對每一種生物進行研究和評價是不現(xiàn)實的,因此通常選擇部分可能暴露于外源殺蟲蛋白下的非靶標(biāo)生物作為安全性評價的對象。在評價對象的選擇上,據(jù)稻田及周邊生態(tài)系統(tǒng)中物種在食物網(wǎng)中的位置和功能特點,可以將用于抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻安全性評價的非靶標(biāo)生物分成以下4類。(1)非靶標(biāo)的植食性害蟲:以水稻為食的靶標(biāo)害蟲之外的害蟲。以轉(zhuǎn)Bt基因水稻為例,主要包括稻飛虱、稻葉蟬、稻薊馬、稻蚜蟲、稻癭蚊等田間害蟲及麥蛾、谷蠹等倉儲害蟲?？瓜x轉(zhuǎn)基因水稻除可能對非靶標(biāo)害蟲有直接毒性之外,還可能因抑制靶標(biāo)害蟲的發(fā)生而改變非靶標(biāo)害蟲的生態(tài)位,進而間接影響非靶標(biāo)害蟲的發(fā)生甚至災(zāi)變,因此對它們進行安全性評價十分必要。(2)非靶標(biāo)的害蟲天敵:寄生或捕食水稻靶標(biāo)和非靶標(biāo)害蟲的天敵,包括寄生蜂、蜘蛛、捕食蝽、瓢蟲等。天敵是稻田各類害蟲的關(guān)鍵控制因子,是抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻非靶標(biāo)生物影響最重要的研究和評價對象。(3)非靶標(biāo)的中性生物:不直接為害水稻亦不捕食或寄生水稻害蟲的一類生物,包括稻田搖蚊、彈尾蟲及土壤微生物等。其中,搖蚊、彈尾蟲等是稻田生態(tài)系統(tǒng)中捕食性天敵的重要獵物,其豐盛度無疑直接影響和維系著捕食性天敵的種群數(shù)量,進而關(guān)系到天敵對害蟲的控制能力(郭玉杰等1995),是抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻生態(tài)安全性評價的重要對象。(4)非靶標(biāo)的經(jīng)濟昆蟲:稻區(qū)常存在家蠶等經(jīng)濟昆蟲,尤其在我國江浙地區(qū),稻區(qū)田間地頭常見桑樹,水稻花粉可能飄落桑葉上被家蠶取食,因此,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對家蠶的安全性一直是人們關(guān)注的焦點之一。3轉(zhuǎn)黨藥物共作基因的研究迄今,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對非靶標(biāo)生物影響的研究主要集中于轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因的‘華恢1號’、Bt‘汕優(yōu)63’和TT9-3、TT9-4,轉(zhuǎn)cry1Ab基因的克螟稻(KMD1、KMD2、KMD3)、B1和B6及轉(zhuǎn)cry1Ac+CpTI(sck)基因的MSA、MSB、MSB4和‘科豐6號’等,主要研究結(jié)果按非靶標(biāo)的植食性害蟲、天敵、土壤生物及經(jīng)濟昆蟲分別歸納如下:3.1水稻對黑尾葉執(zhí)行情況的影響目前研究較多的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻是以鱗翅目害蟲為靶標(biāo)的轉(zhuǎn)Bt或CpTI基因抗蟲水稻,其非靶標(biāo)植食性害蟲包括稻飛虱、稻葉蟬、稻薊馬、稻癭蚊等田間害蟲以及麥蛾、谷蠹等倉儲害蟲。(1)稻飛虱:包括褐飛虱、白背飛虱等種類,是我國水稻最主要的害蟲,為抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻非靶標(biāo)影響的關(guān)注重點。室內(nèi)轉(zhuǎn)基因水稻上的飼養(yǎng)實驗結(jié)果表明,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對褐飛虱的取食選擇性(Bernal等2002;傅強等2003)、產(chǎn)卵選擇性(傅強等2003)、若蟲發(fā)育和存活率(Bernal等2002Chen等2011)、藥劑敏感性(李兆亮等2011)均沒有明顯影響;亦有報道發(fā)現(xiàn)Bt稻不利于褐飛虱的取食(陳茂等2004),或?qū)θ粝x發(fā)育質(zhì)量(傅強等2003Chen等2012)、產(chǎn)卵(Chen等2012)有一定抑制作用。抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對白背飛虱的若蟲發(fā)育速率(傅強等2003)、產(chǎn)卵量和卵孵化率(傅強等2003譚紅等2006)等均無明顯影響,也有報道發(fā)現(xiàn)Bt稻對白背飛虱的若蟲發(fā)育速率(譚紅等2006)或發(fā)育質(zhì)量(傅強等2003)不利。大量的田間種群動態(tài)調(diào)查亦發(fā)現(xiàn),抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻田間稻飛虱的優(yōu)勢種組成、發(fā)生動態(tài)和發(fā)生數(shù)量與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账緹o顯著差異,或數(shù)量有所降低(傅強等2003;Chen等2006b,2007;劉雨芳等2007;陳洋等2011;隋賀等2011),與室內(nèi)研究結(jié)果一致。但亦有少數(shù)研究報道結(jié)果不同,劉志誠等(2002)報道轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT9-3移栽后早中期白背飛虱若蟲的田間數(shù)量顯著高于對照;Wang等(2010)則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻Bt‘汕優(yōu)63’田間后期褐飛虱蟲量顯著較高,其中前者沒有在Chen等(2006a)對TT9-3的兩年三地田間系統(tǒng)研究中證實,應(yīng)是田間實驗的一種偶發(fā)現(xiàn)象后者則可能是間接效應(yīng)所致,非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗锸馨袠?biāo)害蟲的嚴(yán)重為害時,田間長勢差,不利于褐飛虱發(fā)生,進而導(dǎo)致其發(fā)生量低于Bt‘汕優(yōu)63’。筆者曾觀察到不防治水稻田褐飛虱和白背飛虱的發(fā)生量顯著低于前期防治的稻田(待發(fā)表資料),類似的現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因棉花田間非靶標(biāo)害蟲的研究中亦有報道(Fitt和Daly1994)。(2)稻葉蟬:我國南方地區(qū)水稻常見害蟲。周霞等(2005)報道,室內(nèi)觀察結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因水稻KMD1、KMD2植株上黑尾葉蟬的產(chǎn)卵量、凈生殖率均顯著高于對照‘秀水11’;田間調(diào)查亦發(fā)現(xiàn)KMD2上黑尾葉蟬種群數(shù)量高于‘秀水11’。劉志誠等(2002)報道轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT9-3移栽后中后期田間黑尾葉蟬若蟲密度顯著高于對照IR72。但劉志誠等(2002)同時發(fā)現(xiàn)TT9-3田間黑尾葉蟬成蟲的蟲口密度與IR72無顯著差異,轉(zhuǎn)cry-1Ab/cry1Ac基因TT9-4上的黑尾葉蟬成蟲與若蟲數(shù)量均與IR72無顯著差異;Chen等(2006a)則通過兩年三地調(diào)查進一步研究發(fā)現(xiàn)TT9-3田間葉蟬的優(yōu)勢種組成及發(fā)生動態(tài)與對照水稻無顯著差異。劉雨芳等(2007)對轉(zhuǎn)cry1Ab+sck基因水稻恢復(fù)系MSA、MSB、MSA4及雜交稻21S/MSB、II-32A/MSB與KF6-304的研究則發(fā)現(xiàn),21S/MSB、II-32A/MSB上的葉蟬數(shù)量顯著或極顯著高于其對照,但葉蟬數(shù)量很低(<35頭·百叢-1),單種葉蟬的種群數(shù)量則更低,且MSA、MSB、MSA4與KF6-304沒有引起稻田葉蟬數(shù)量的明顯變化。(3)稻薊馬:水稻苗期的常見害蟲。轉(zhuǎn)基因水稻KMD1、KMD2、B1、B6及TT9-3、TT9-4對稻薊馬的發(fā)育、壽命和產(chǎn)卵有一定的負面影響,且田間蟲口數(shù)量相對較低,不利于稻薊馬的發(fā)生(Akhtar等2010),但亦有報道發(fā)現(xiàn)KMD2田間稻薊馬的發(fā)生較重(唐健等2000)。(4)稻癭蚊:我國南方部分稻區(qū)主要水稻害蟲。劉雨芳等(2007)報道,MSA、MSB在成熟收割前有增加無效分蘗上稻癭蚊引起的蔥管數(shù)的態(tài)勢,但在水稻生長中期對稻癭蚊有一定的抗性,能減少蔥管的形成,降低標(biāo)蔥率,認(rèn)為轉(zhuǎn)基因水稻上田間稻癭蚊災(zāi)變的風(fēng)險較少。(5)倉儲害蟲:為害稻谷或稻米的害蟲有多種。研究發(fā)現(xiàn),克螟稻、Bt‘汕優(yōu)63’稻谷對麥蛾(蔡萬倫等2006;李光濤等2008)、印度谷螟(蔣海燕等2011)等鱗翅目害蟲有明顯抑制作用,但對赤擬谷盜、谷蠹、嗜卷書虱等其他目儲糧害蟲無明顯影響(蔡萬倫等2006,2008)?？偵纤?多數(shù)研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)Bt或Bt+CpTI基因水稻對褐飛虱、白背飛虱、稻薊馬等非靶標(biāo)害蟲的生長、發(fā)育、繁殖、寄主選擇行為及田間蟲口數(shù)量均無顯著影響或有一定的抑制作用,引起非靶標(biāo)害蟲災(zāi)變的風(fēng)險極小。少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻可能有利于非靶標(biāo)植食性害蟲的發(fā)生其中部分結(jié)果可能是田間害蟲分布不均所致;而B‘汕優(yōu)63’田間后期褐飛虱蟲量顯著較高(Wang等2010),則可能源于靶標(biāo)害蟲為害造成的間接效應(yīng)可通過常規(guī)防治方法實現(xiàn)Bt稻褐飛虱的防治,其災(zāi)變風(fēng)險易于得到控制。此外,盡管KMD1、KMD2似有利于黑尾葉蟬的發(fā)生(周霞等2005),但因稻田葉蟬蟲口數(shù)量較低,一般可以在稻飛虱防治時得到兼治,其災(zāi)變風(fēng)險亦較小。3.2影響非目標(biāo)檢測昆蟲天敵的影響害蟲天敵包括捕食性天敵和寄生性天敵兩大類,以往研究主要包括對這兩類天敵的多樣性及代表性種類的研究。3.2.1抗蟲基因水稻對天敵的影響捕食性天敵是稻田害蟲的主要控制因子之一,在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻非靶標(biāo)天敵安全性評價中備受關(guān)注。關(guān)注的第一個問題是天敵能否接觸到轉(zhuǎn)基因水稻的殺蟲蛋白?據(jù)姜永厚等(2004a)的研究,取食KMD1的二化螟、稻眼蝶、褐飛虱、稻蚜及飼喂以KMD1為食的二化螟或稻眼蝶幼蟲的擬水狼蛛體內(nèi)都能檢測到Cry1Ab蛋白,其中,稻眼蝶體內(nèi)的含量最高;以稻眼蝶為食的擬水狼蛛體內(nèi)CrylAb含量是以二化螟為食的狼蛛的約60倍。Chen等(2009)亦發(fā)現(xiàn)取食KMD1、KMD2的稻縱卷葉螟及以此為食的擬水狼蛛體內(nèi)均能檢測到Cry1Ab蛋白。此外,研究發(fā)現(xiàn)取食Bt稻上植食性昆蟲的黑肩綠盲蝽(Bernal等2002)、尖鉤寬黽蝽(白耀宇等2005a)、龜紋瓢蟲(Bai等2006)等均能接觸到Bt蛋白。顯然,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻表達的殺蟲蛋白可以在“水稻-植食性害蟲-天敵”食物鏈中傳遞。然而Bt蛋白對天敵的直接影響取決于其消化道中是否Bt蛋白受體,已證實擬水狼蛛的消化道中不存在Cry1Ab蛋白受體(Chen等2009)。關(guān)注的另一個問題是,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對捕食性天敵的實際影響效應(yīng)如何?有不少研究者通過室內(nèi)生物學(xué)觀察或田間系統(tǒng)調(diào)查開展了研究?？傮w上,轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻KMD1、KMD2、B1和B6(Li等2007;劉志誠等2011)、MSA和MSB(劉雨芳等2005)、TT9-3和TT9-4(劉志誠等2002,2003;Li等2007)對田間捕食性天敵物種構(gòu)成、物種豐富度和多樣性均無顯著影響。各類主要天敵的影響效應(yīng)研究結(jié)果如下:(1)蜘蛛:廣譜性的稻田主要捕食性天敵。以轉(zhuǎn)基因水稻KMD1、KMD2上靶標(biāo)害蟲——稻縱卷葉螟為獵物,擬水狼蛛體的發(fā)育歷期有所延長,但存活率、產(chǎn)卵量和田間種群密度均沒有明顯變化;其中發(fā)育歷期的變化可能是因取食轉(zhuǎn)基因水稻的獵物營養(yǎng)質(zhì)量較差所導(dǎo)致,而非Cry1Ab蛋白的直接影響(Chen等2009)。以KMD1和TT9-3非靶標(biāo)害蟲——褐飛虱為獵物,食蟲溝瘤蛛的存活率、發(fā)育歷期、繁殖力均與對照無顯著差異,且兩地三年的田間種群數(shù)量調(diào)查亦未見與對照有顯著差異(Tian等2010)。在KMD1、KMD2田間采集的擬環(huán)紋豹蛛的免疫學(xué)指標(biāo)與對照田采集的無顯著差異(田俊策等2011)。(2)黑肩綠盲蝽:稻飛虱的重要捕食性天敵。Bernal等(2002)對轉(zhuǎn)cry1Ab基因水稻ChinsurahBoroII、Zhong8215和TaromMolaii及轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因水稻Bt-IR72的研究表明,以Bt稻上的褐飛虱為獵物,黑肩綠盲蝽的存活與發(fā)育均無顯著差異。Chen等(2007)亦通過兩年三地的田間觀察,發(fā)現(xiàn)KMD1田間的黑肩綠盲蝽的數(shù)量與對照無顯著差異。(3)其他:飼喂KMD1和KMD2上的植食性害蟲或花粉,對尖鉤寬黽蝽的捕食量和功能反應(yīng)(白耀宇等2005a)、龜紋瓢蟲的生長發(fā)育繁殖和活動能力(Bai等2005,2006)及中華草蛉的成蟲壽命和繁殖力(白耀宇等2005b)均無顯著影響。3.2.2田間算例2對3種特殊天敵的影響寄生性天敵是稻田害蟲的又一主要控制因子。與食性較廣的捕食性天敵不同,多數(shù)寄生性天敵寄主單一。顯然,對于以轉(zhuǎn)基因水稻靶標(biāo)害蟲為主要寄主的寄生性天敵,勢必因轉(zhuǎn)基因水稻殺死了靶標(biāo)害蟲而受到負面影響;此外,即使靶標(biāo)害蟲沒有死亡,但其生長發(fā)育可能受到抑制,進而影響寄生性天敵。如,以KMD1、MSB飼喂處理的二化螟幼蟲為寄主,盡管二化螟絨繭蜂的繭塊大小、羽化率、性比、成蜂壽命等均無顯著差異,但其寄生率均降低(姜永厚等2004b,2005)。田間系統(tǒng)調(diào)查進一步證實這種負面影響,KMD對田間靶標(biāo)害蟲寄生蜂(尤其繭蜂)數(shù)量具一定負面影響(田俊策等2008),TT9-3和TT9-4田間寄生靶標(biāo)害蟲的繭蜂或姬蜂科的優(yōu)勢度有時明顯低于對照(劉志誠等2003),MSA、MSB、MSA4和KF6-304水稻生長中期寄生蜂數(shù)量有所減少(劉雨芳等2006)。同時,稻田中還存在大量非靶標(biāo)害蟲的寄生性天敵或寄主范圍較廣的寄生性天敵。田間系統(tǒng)調(diào)查結(jié)果表明,KMD1和KMD2田間非靶標(biāo)害蟲——稻飛虱卵的被寄生率和死亡率無顯著影響(高明清等2011)?？傮w上,KMD1和KMD2田間寄生性天敵的各科組成、物種豐富度和多樣性指數(shù)與對照稻田無顯著差異(田俊策等2008;劉志誠等2011),MSA、MSB、MSA4和KF6-304對田間寄生蜂亞群落的物種豐富度、多樣性指數(shù)沒有顯著影響(劉雨芳等2006)。從上述研究看出,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對靶標(biāo)害蟲的寄生性天敵有明顯負面效應(yīng),鑒于靶標(biāo)害蟲可由轉(zhuǎn)基因水稻控制,其寄生性天敵的減少對其有效控制的影響不大;轉(zhuǎn)基因水稻對捕食性天敵的影響小,其生態(tài)風(fēng)險幾乎可以忽略不計。3.3bt稻對bt尾蟲的影響B(tài)t作物表達的Bt蛋白可以通過植株殘體、根及根系分泌物、花粉等途徑進入土壤(袁一楊和戈峰2010;周學(xué)永等2011)。對轉(zhuǎn)基因水稻的研究發(fā)現(xiàn),KMD1、KMD2稻草在自然條件下歷經(jīng)160d仍含Cry1Ab蛋白(白耀宇等2006);而摻入土壤的Cry-1Ab蛋白在好氣條件和灌水條件下的降解半衰期分別為19.6~41.3d和45.9~141d(Wang等2007),這些研究說明Cry1Ab蛋白可以在土壤中殘留較長時間。土壤中殘留的蛋白或遺留土表的轉(zhuǎn)基因殘株是否對土壤或土表生物產(chǎn)生潛在影響?在抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻非靶標(biāo)生態(tài)安全性評價中頗受關(guān)注,主要見于土表彈尾蟲、土壤細菌等非靶標(biāo)生物的研究。(1)稻田彈尾蟲:種類和個體數(shù)量都較豐富,作為分解者在參與土壤物質(zhì)循環(huán)、提高土壤肥力、改善土壤理化特性、維護土壤生物群落等方面有重要作用(袁一楊和戈峰2010);還可為尖鉤寬黽蝽等稻田天敵捕食(白耀宇等2005a),是稻田“水稻-植食性昆蟲-天敵”食物鏈的重要一環(huán)。研究表明,以KMD1、KMD2腐爛莖葉為食的彈尾蟲體內(nèi)可檢測到Cry1Ab蛋白(白耀宇等2005a),KMD1、KMD2稻田灰橄欖長角跳蟲等彈尾蟲的種群數(shù)量顯著高于對照稻田(白耀宇等2005a,2006),進一步的兩地三年觀察發(fā)現(xiàn)這2種Bt稻收割后,田間彈尾蟲的種類構(gòu)成和物種豐富度與對照田無明顯差異(Bai等2010)。但是,‘華恢1號’土壤優(yōu)勢彈尾蟲屬長角跳屬和原等屬的田間數(shù)量與對照水稻差異顯著,只是該結(jié)果系一年的數(shù)據(jù)(吳剛等2012),尚需進一步研究確定。(2)土壤微生物:土壤微生物群落是土壤中的活性組分,是土壤分解系統(tǒng)的主導(dǎo)者,對營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)和土壤性質(zhì)起到至關(guān)重要的作用,因此研究轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響是轉(zhuǎn)基因作物生態(tài)安全性評價的重要組成部分(王北艷和殷奎德2012)。研究發(fā)現(xiàn),Bt稻對土壤中好氧性細菌、放線菌、真菌的數(shù)量和土壤蛋白酶、中性磷酸酶、脲酶和土壤呼吸強度(吳偉祥等2003b)及土壤蔗糖酶、芳香硫酸酯酶和脫氫酶活性(Sun等2003)、土壤微生物的生物量氮(李修強等2012a)等均沒有顯著影響,對淹水條件下土壤磷酸酶活性的影響亦較小(吳偉祥等2003a)。KMD1連續(xù)2年種植對根際微生物構(gòu)成及酶活性均無顯著影響(Liu等2008);KMD1和KMD2根際可培養(yǎng)細菌群落的優(yōu)勢度指數(shù)、多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)均與對照無顯著差異(楊保軍等2009)。然而,轉(zhuǎn)基因水稻亦對土壤微生物的部分指標(biāo)有顯著影響。如:Bt稻土壤脲酶活性顯著下降、土壤酸性磷酸酶活性顯著提高(Sun等2003),土壤反硝化細菌和產(chǎn)甲烷細菌種群受到顯著抑制、厭氧發(fā)酵細菌種群則顯著增加(徐曉宇等2004),根際土壤優(yōu)勢菌群改變(陳敏等2005),根際葡萄球菌屬、棒桿菌屬和壤霉菌屬數(shù)量顯著較高,而束毛球菌屬數(shù)量則顯著較低(楊保軍等2009)。此外,轉(zhuǎn)基因水稻對一些土壤微生物指標(biāo)的影響常表現(xiàn)出階段性特點。如,在添加KMD秸稈的土壤中,僅前期土壤脫氫酶活性明顯較高,而后期這種差異逐漸消失(吳偉祥等2003b);含KMD的淹水土壤中,可培養(yǎng)厭氧細菌的數(shù)量和群落組成僅在初期有顯著差異,而后期這種差異消失(任馨等2004);KMD、‘華恢1號’和Bt‘汕優(yōu)63’對土壤微生物生物量碳、基礎(chǔ)呼吸和微生物代謝熵的影響在大田種植第1年的部分時段有顯著影響,第2年這種影響不明顯(李修強等2012a)。(3)其他:除上述土壤生物外,線蟲、螨類亦是稻田土壤或土表較重要的生物。吳剛等(2012)在‘華恢1號’田間觀察到20個線蟲屬及11個螨類屬的分布,除中桿屬線蟲、尖棱甲螨屬螨蟲的種群數(shù)量顯著降低,鉤唇屬線蟲種群數(shù)量顯著增加外,其他多數(shù)屬的線蟲和螨蟲的種群數(shù)量與對照無顯著差異。李修強等(2012b)則研究了Bt‘汕優(yōu)63’田間土壤線蟲,發(fā)現(xiàn)除個別時間段多樣性指數(shù)差異顯著外,總體上土壤線蟲的數(shù)量、群落組成與對照無顯著差異?？傮w上,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對土壤或土表中性生物的影響不大,少部分指標(biāo)雖然前期有顯著影響,但隨時間延長而影響不顯著。還有少部分指標(biāo)的差異一直較明顯,其對土壤生物生態(tài)平衡及土壤功能的潛在影響還需進一步研究。3.4水稻花粉的群落及對家蠶的影響抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻表達的Bt蛋白一般對鱗翅目害蟲有毒,其對稻區(qū)鱗翅目經(jīng)濟昆蟲的影響頗受關(guān)注。家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲,在我國桑蠶主產(chǎn)區(qū)(如浙江、江蘇),水稻和桑林常常相鄰種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻花粉是否有可能飄落到臨近的桑葉上,進而對家蠶飼養(yǎng)造成潛在影響?對浙江杭州桑稻混種地區(qū)水稻花粉向桑葉飄落情況的研究發(fā)現(xiàn),在稻田附近(<10m)范圍內(nèi)約54.5%的桑葉可檢測到水稻花粉,其平均花粉密度為92.9?！m-2(樊龍江等2003)。室內(nèi)生測實驗結(jié)果表明,飼喂附著(109.1±50.6)?！m-2的Bt稻(KMD3與‘浙輻504’的雜交后代BC3F5)花粉的桑葉,對家蠶1~3齡幼蟲的存活率與體重均無顯著影響(王忠華等2001)。但不同家蠶品系對Bt稻花粉的敏感性有所不同,飼喂每克含0.05gB1稻花粉的飼料,除對夏秋蠶雜交種——‘豐一’×54A無顯著影響外,對其親本‘豐一’、54A及春蠶雜交種‘青松’ב皓月’及親本‘青松’、‘皓月’均有顯著影響(袁志東等2006)。Yao等(2006)進一步發(fā)現(xiàn)緊鄰轉(zhuǎn)基因水稻TT9-3的桑葉花粉飄落密度平均為62.3粒·cm-2,最高花粉飄落1636?！m-2,分別相當(dāng)于對家蠶急性毒性的LC