單寧酸與牛血紅蛋白分子相互作用的熒光光譜研究

單寧酸與牛血紅蛋白分子相互作用的熒光光譜研究

單寧酸作為一種傳統(tǒng)藥物和配方的活性成分，具有止血、抑制微生物、抗過敏、突變、抗癌、抗瘤、抗衰老等生理活性。有關(guān)單寧酸與蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)成為了皮革工業(yè)、醫(yī)藥學(xué)、分析化學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點。單寧酸與蛋白質(zhì)作用的模式和作用力類型的研究也顯得極為重要。關(guān)于有機(jī)藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理,人們從作用位點、作用力模型及其結(jié)合形態(tài)方面進(jìn)行闡述,生物醫(yī)學(xué)中單寧酸與血清白蛋白的研究較多,而其與血紅蛋白相互作用的文獻(xiàn)報道較少。為此本文對有機(jī)分子單寧酸和血紅蛋白相互作用進(jìn)行了熒光光譜分析,為進(jìn)一步研究闡明單寧與蛋白作用的實質(zhì)奠定一定實驗基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究生物大分子和有機(jī)藥物分子相互作用本質(zhì)提供理論依據(jù)。1實驗部分1.1水能、水純水及試劑LS-50B型熒光光度計(美國Perkin-Elmer公司);UV/Vis紫外-可見光譜儀(德國);PHS-3C型精密pH計(上海雷磁儀器廠);ZC-18Q智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠);高純水制備儀(日本Millipore公司)。單寧酸(生化試劑,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)配制成3.75×10-4mol·L-1的儲備液待用;牛血紅蛋白(購于Sigma公司),用三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液(內(nèi)含0.15mol·L-1NaCl維持離子強度)配制成3.0×10-6mol·L-1儲備溶液并于冰箱中(溫度低于5℃)保存。除Tris為生化試劑外,其余試劑均為分析純試劑,實驗用水為高純水(電阻率為18.2MΩ·cm-1)。1.2熒光掃描和同步熒光光譜移取2.5mL3.0×10-6mol·L-1BHb溶液于1cm的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入3.75×10-4mol·L-1的單寧酸溶液進(jìn)行熒光滴定(滴定劑累加體積小于65μL),每次加入溶液后混合均勻,在一定溫度下作用10min后,于280nm激發(fā)波長下進(jìn)行熒光掃描。光源為脈沖氙燈,發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度均為5.0nm,掃描速度500nm·min-1,在LS-50B型熒光分光光度計上記錄290nm~400nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜;固定△λ=15nm或△λ=60nm,記錄單寧酸與BHb作用的同步熒光光譜。以Tris-HCl緩沖液為溶劑稀釋單寧酸儲備液,配制3.0×10-6mol·L-1的溶液測定其在290nm~400nm的UV/Vis譜圖。2結(jié)果與討論2.1熒光n,b對-33trp的熒光實驗設(shè)計圖1為是激發(fā)光波長為280nm時,血紅蛋白的熒光發(fā)射光譜隨單寧酸濃度變化的譜圖。由圖1可觀察到在341nm處的1個強的寬熒光發(fā)射峰,為BHb中色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發(fā)射峰,單寧酸的加入使其熒光強度降低,表明二者發(fā)生了相互作用,發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。另外隨著單寧酸濃度的增加,BHb的熒光發(fā)射峰的峰位由341nm紅移至353nm,說明單寧酸與BHb的結(jié)合使BHb分子的空間構(gòu)象發(fā)生了改變,由于位于血紅蛋白疏水腔內(nèi)的β-37Trp是血紅蛋白內(nèi)源熒光的主要來源,其熒光的變化能夠體現(xiàn)血紅蛋白四級空間構(gòu)象的改變,因此單寧酸分子在一定程度上對β-37Trp的熒光猝滅表明其影響了BHb的載氧功能。熒光猝滅過程通?？梢苑譃閯討B(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用引起的,其過程遵循Stern-Volmer方程:F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q](1)式中F0和F分別表示不加入和加入猝滅劑時體系的相對熒光強度;Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)(即Stern-Volmer猝滅常數(shù));[Q]為猝滅劑的濃度;Kq為熒光猝滅速率常數(shù),各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq值一般為2.0×1010L·mol-1·s-1;τ0為不存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命一般約為10-8s。根據(jù)圖1,假設(shè)單寧酸對BHb的熒光猝滅過程為動態(tài)猝滅,則由式(1)作出熒光發(fā)射峰在341nm處BHb熒光猝滅的Stern-Volmer曲線,由直線的斜率及截矩可求出不同溫度下結(jié)合反應(yīng)的Ksv和Kq,計算結(jié)果見表1。從表1可以看出,Kq的數(shù)值在1013數(shù)量級,遠(yuǎn)大于動態(tài)猝滅的Kq值2.0×1010L·mol-1·s-1,隨著溫度的升高KSV有所降低,從這種意義上考慮,單寧酸對BHb的熒光猝滅作用不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是單寧酸與BHb形成了基態(tài)復(fù)合物,對BHb內(nèi)源性熒光的猝滅過程應(yīng)為靜態(tài)猝滅。2.2最佳相互作用的確定作用力類型單寧酸對BHb的猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅,二者的結(jié)合符合熒光物質(zhì)-猝滅劑間的結(jié)合表達(dá)式:logF0?FF=logKA+nlog[Q](2)logF0-FF=logΚA+nlog[Q](2)式中[Q]為溶液中單寧酸的濃度。由式(2)作log[(F0-F)/F]~log[Q]圖,由圖中直線的斜率及截矩計算不同溫度下單寧酸與BHb表觀結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點數(shù)n,結(jié)果見表2,數(shù)據(jù)表明,單寧酸與BHb分子之間具有較強的相互作用,并能夠形成復(fù)合物。當(dāng)溫度變化不大時,結(jié)合反應(yīng)的焓變ΔH?可看成一個常數(shù),根據(jù)下列熱力學(xué)公式(3~5)可以求得結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變ΔG?、焓變ΔH?、熵變ΔS?(見表2)。ΔG?=-RTlnK?(3)ΔS?=(ΔH?-ΔG?)/T(4)lnK?2K?1=ΔH?R(1T11T2)(5)lnΚ2?Κ1?=ΔΗ?R(1Τ11Τ2)(5)根據(jù)藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)可以簡單判斷其相互作用力類型:若ΔH?<0及ΔS?>0時,主要表現(xiàn)為靜電作用;若ΔH?<0及ΔS?<0時,主要表現(xiàn)為氫鍵或范德華作用力;若ΔH?>0及ΔS?>0時,主要表現(xiàn)為疏水作用。單寧多酚中的棓酰基是一種疏水性基團(tuán),它使多酚能夠很好的與蛋白質(zhì)分子中的疏水位置發(fā)生疏水締合,疏水鍵應(yīng)該是單寧酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的一種重要結(jié)合方式。從表2可以判斷,單寧酸與BHb的結(jié)合是一個自發(fā)過程(ΔG?<0);單寧酸與BHb結(jié)合的ΔH?>0,ΔS?>0,可以確定單寧酸與BHb分子間主要存在疏水作用;同時,多酚的酚羥基與蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)發(fā)生兩點氫鍵結(jié)合,因此單寧酸與BHb分子間存在一定的氫鍵結(jié)合作用。2.3熒光量子產(chǎn)率的計算方法根據(jù)F?rster能量轉(zhuǎn)移理論,能量轉(zhuǎn)移效率E與供體-受體間距離r以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間的關(guān)系為:E=1?FF0=R60R60+r6(6)E=1-FF0=R06R06+r6(6)式中R0為E=50%時臨界距離,R6006=8.79×10-25K2N-4?J(7)式中K2為偶極空間取向因子,N為介質(zhì)的折射系數(shù),?為供體(BHb)的熒光量子產(chǎn)率,J為供體(BHb)熒光光譜與受體(單寧酸)吸收光譜的重疊積分J=∫∞0F(λ)ε(λ)λ4dλ∫∞0F(λ)dλ(8)J=∫0∞F(λ)ε(λ)λ4dλ∫0∞F(λ)dλ(8)式中F(λ)為熒光供體(BHb)在波長λ處的熒光強度,ε(λ)為受體(單寧酸)在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。圖2為BHb熒光發(fā)射光譜與單寧酸吸收光譜的重疊圖,由(8)式計算的重疊積分J=2.47×10-14cm3·L·mol-1;取向因子取供體-受體各項隨機(jī)分布的平均值,即K2=2/3;根據(jù)文獻(xiàn)取BHb中色氨酸殘基的熒光量子產(chǎn)率Φ為0.062,N折射指數(shù)取水和有機(jī)物平均值N為1.336;將上述數(shù)值代入式(6)、(7)求得E=0.117;R0=2.56nm,r=3.59nm,同時從計算的結(jié)果看出,單寧酸與BHb分子中色氨酸殘基的距離r<7nm,且0.5R0<r<1.5R0,表明BHb與單寧酸之間存在能量轉(zhuǎn)移的可能性較大,另外r>R0,說明單寧酸對BHb內(nèi)源性熒光的猝滅過程主要為靜態(tài)猝滅。2.4單寧酸對brb分子中氨基酸和色氨酸殘基的作用同步熒光具有靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點,通過選擇合適的波長差可將在普通熒光光譜上相互重疊的熒光峰分開。對于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,△λ=15nm時僅表現(xiàn)為酪氨酸殘基的熒光,△λ=60nm時則顯示色氨酸殘基的熒光。因殘基的最大發(fā)射波長與其所處環(huán)境的極性有關(guān),故由發(fā)射波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。若最大發(fā)射波長紅移,表明殘基所處環(huán)境的極性增加,疏水性降低,蛋白結(jié)構(gòu)變得疏松;藍(lán)移則疏水性增加,蛋白結(jié)構(gòu)變得緊密。固定BHb濃度,逐漸增大單寧酸的濃度,繪制BHb的同步熒光光譜。分別選擇波長差△λ=15nm和△λ=60nm考察單寧酸對BHb分子中酪氨酸和色氨酸殘基的影響(圖3A、B)。從圖中可以看出,隨著單寧酸濃度增大,酪氨酸和色氨酸殘基熒光被猝滅,特征熒光光譜峰位置發(fā)生紅移,表明單寧酸對酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境有一定的影響。在血紅蛋白α1β2亞基界面的α-42Tyr,α-140Tyr,β-37Trp和β-145Ty