中耳膽脂瘤基質(zhì)金屬蛋白酶2,9活性的檢測

中耳膽脂瘤基質(zhì)金屬蛋白酶2,9活性的檢測

骨溶解性破壞是膽脂瘤中耳炎最重要的臨床特征和病理生理過程。周圍骨骼的破壞是通過緩慢的和入侵而進(jìn)行的，可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的顱內(nèi)并發(fā)癥。現(xiàn)在已普遍認(rèn)為,膽脂瘤中骨基質(zhì)降解是由于鄰近骨細(xì)胞(破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞)、肉芽組織或膽脂瘤上皮釋放的蛋白水解酶所致。膠原占骨有機(jī)基質(zhì)的90%以上,基質(zhì)金屬蛋白酶2,9(matrixmetalloproteinases2,9,MMP2,9)是膠原的主要降解酶之一。近年來,國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用免疫組織化學(xué)法定性研究表明MMP2和MMP9在膽脂瘤的表達(dá)增高,但有關(guān)膽脂瘤中MMP2,9活性的定量研究較少,且尚無明確結(jié)論。我們用明膠酶譜法測定MMP2,9的活性,探討MMP2,9與膽脂瘤破壞骨質(zhì)的關(guān)系。1數(shù)據(jù)和方法1.1膽脂瘤臨床分型收集2001年8月～2003年4月在我科手術(shù)的膽脂瘤型中耳炎(包括膽脂瘤上皮及上皮下結(jié)締組織)標(biāo)本41例,同時收集術(shù)耳外耳道皮膚20例作為對照組,保存于-30℃冰箱中備檢測。41例均經(jīng)臨床和病理確診為膽脂瘤型中耳炎,其中男26例,女15例;年齡5～63歲,平均31歲;左耳18例,右耳23例;復(fù)發(fā)性膽脂瘤6例,初發(fā)性35例;平均耳流膿15.8年。根據(jù)顳骨CT和手術(shù)所見將41例分為廣泛型膽脂瘤25例和局限型膽脂瘤16例。膽脂瘤占據(jù)鼓室、鼓竇及整個乳突腔,相鄰部位骨質(zhì)和聽小骨有明顯破壞者為廣泛型膽脂瘤;膽脂瘤局限于上鼓室及鼓竇,周圍骨質(zhì)和聽小骨破壞不明顯者為局限型膽脂瘤。1.2明膠酶譜法測定1.2.1離心離心法用4℃生理鹽水清洗標(biāo)本,濾紙吸干,按每30mg標(biāo)本加勻漿液2.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)1ml。在4℃玻璃勻漿器中勻漿,置低溫高速離心機(jī)中離心,12000r/min(半徑=9.5cm)×15min,取上清液存貯備用。取200μl上清液,用2.5%SDS稀釋到4.0ml,用雙光束紫外分光光度計(LAMBDABIO20,美國)測量吸收度(A),并計算蛋白質(zhì)含量。1.2.2凝膠的預(yù)處理及酶活性測定本試驗采用明膠酶譜法測定,取5μl上清液與5μl樣品緩沖液混勻,加樣于4%濃縮膠,10%分離膠(含0.1%明膠),SDS不連續(xù)系統(tǒng)垂直板型凝膠電泳,電流15mA,電泳約1.5h。將凝膠置于洗脫液中振蕩45min×2次,再用漂洗液漂洗20min×2次,以上各步均在4℃進(jìn)行。再將凝膠置孵育液中37℃孵育約42h。經(jīng)染色液染色2h,脫色液A,B,C分別脫色15,30,60min。顯示出MMP2和MMP9為位于藍(lán)色背景下的透光帶。凝膠經(jīng)反轉(zhuǎn)成像后,使酶解活性表現(xiàn)為白色背景上的黑色條帶,經(jīng)凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(BIO-RADGelDoc2000,美國)讀取條帶面積和灰度。條帶酶解量=條帶面積×(條帶灰度-背景灰度),酶活性=酶解量÷樣品蛋白濃度,單位為灰度面積·mg-1·ml-1。中分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(上海Promega公司生產(chǎn)):雞蛋清溶菌酶14400,牛碳酸酐酶31000,雞蛋卵清蛋白42700,牛血清白蛋白66200,磷酸化酶b(兔肌)97400。1.3統(tǒng)計學(xué)處理計量資料用xˉ±sxˉ±s表示,應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗,配對設(shè)計的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗,二元變量相關(guān)性分析(Pearson相關(guān))。2膽脂瘤mmp9活性41例中耳膽脂瘤凝膠電泳在分子量72000和92000處均分別顯示出MMP2和MMP9活性條帶(圖1),而20例外耳道皮膚中有18例顯示出MMP2活性,2例標(biāo)本未顯示電泳條帶,19例顯示出MMP9活性,1例無電泳條帶。膽脂瘤組織中MMP2和MMP9的活性均較外耳道皮膚高(P<0.01)。膽脂瘤組織中MMP9的活性較MMP2高(P<0.01),且膽脂瘤組織中MMP2和MMP9活性為正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=0.618,P<0.01。廣泛型膽脂瘤組織中MMP2和MMP9活性較局限型膽脂瘤高(P<0.01);復(fù)發(fā)性與初發(fā)性膽脂瘤MMP2和MMP9活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。兩組間比較,1)P<0.01;與MMP9活性比較,2)P<0.013明膠酶譜法檢測膽脂瘤型中耳炎的骨質(zhì)破壞機(jī)制尚未清楚,近年來國內(nèi)外學(xué)者對中耳膽脂瘤引起的骨質(zhì)破壞機(jī)制進(jìn)行了大量研究,并提出許多理論:如膽脂瘤的機(jī)械壓力作用,慢性感染引起骨髓炎,pH值改變,破骨細(xì)胞的骨溶解作用,酶類介導(dǎo)的骨吸收作用,細(xì)胞因子參加的骨質(zhì)破壞作用等。MMP家族是一個鋅離子依賴性的蛋白酶家族,根據(jù)其作用底物的特異性和敏感性分為3類:間質(zhì)膠原酶、明膠酶和間質(zhì)溶解素,其中明膠酶包括MMP2和MMP9,其作用底物主要是Ⅳ型膠原和明膠。免疫組織化學(xué)研究表明中耳膽脂瘤組織MMP家族表達(dá)較高,MMP家族和金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhi-bitorofmetalloproteinases,TIMPs)表達(dá)失衡,可能參與膽脂瘤骨吸收過程。免疫組織化學(xué)研究表明,膽脂瘤上皮組織MMP2和MMP9的表達(dá)強(qiáng)度高于外耳道皮膚,基底膜染色最強(qiáng)。免疫組織化學(xué)法是利用組織中的抗原與特異性抗體相結(jié)合的原理,定性或半定量地檢測組織中抗原的表達(dá)或含量,但酶表達(dá)或含量的增加并不能代表酶的活性增高,因為MMP家族在體內(nèi)都是以無活性的前酶原形式分泌,分泌后可被胰蛋白酶、纖溶酶等激活,其中纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)一直被認(rèn)為是MMP家族最重要的激活物。而明膠酶譜法通過測定酶降解底物的量反映酶的活性,檢測的靈敏度高,研究結(jié)果更具有說服力。明膠酶譜法有以下優(yōu)點:①能定量檢測標(biāo)本中MMP2和MMP9的活性,能直接分析酶活性的高低;②檢測標(biāo)本中MMP2和MMP9的靈敏度高,為pg級;③實驗的重復(fù)性較好,實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但由于標(biāo)本的處理及實驗操作較復(fù)雜,因此實驗時間較長,且須嚴(yán)格控制實驗條件。目前膽脂瘤組織與外耳道皮膚中MMP2和MMP9活性的高低尚無一致結(jié)論。Banerjee等(1998)應(yīng)用明膠酶譜法研究發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織MMP2和MMP9在72000和92000處的活性與外耳道皮膚無差異性。由于他們研究的病例較少,對MMP2和MMP9在膽脂瘤骨質(zhì)破壞中所起的作用未作進(jìn)一步的分析。Lehman等實驗性膽脂瘤研究也表明MMP2和MMP9活性與外耳道皮膚和鼓膜無差別。而Schmidt等實驗結(jié)果表明膽脂瘤MMP9活性較外耳道皮膚高,而MMP2并不高。本組采用明膠酶譜法測定41例中耳膽脂瘤標(biāo)本中MMP2和MMP9的活性,研究表明膽脂瘤組織MMP2和MMP9活性高于外耳道皮膚。本組研究結(jié)果與國外文獻(xiàn)不一致的可能原因:①膽脂瘤標(biāo)本的處理,比如實驗時取標(biāo)本的部位是否包含膽脂瘤上皮及上皮下結(jié)締組織;標(biāo)本是否及時放置于低溫水箱保存;蛋白質(zhì)抽提方法、電泳前上清液的處理環(huán)節(jié)的差異等。②試劑來源和純度也可能影響結(jié)果。③實驗結(jié)果的判斷和分析方法不同。本研究還發(fā)現(xiàn)廣泛型膽脂瘤MMP2和MMP9活性較局限型膽脂瘤高,提示中耳膽脂瘤MMP2和MMP9活性的高低與膽脂瘤骨質(zhì)破壞的范圍密切相關(guān),MMP2和MMP9活性高,膽脂瘤破壞顳骨的范圍大。相反,膽脂瘤骨質(zhì)破壞的范圍小,且膽脂瘤較為局限。膽脂瘤的復(fù)發(fā)與MMP2和MMP9活性的高低也沒有直接關(guān)系。膽脂瘤組織中MMP2和MMP9的活性呈明顯的正相關(guān)性,表明兩者在膽脂瘤破壞周圍骨質(zhì)中可能有一定的協(xié)同作用。膽脂瘤組織MMP9的活性高于MMP2的活性,表明MMP9在膽脂瘤骨質(zhì)破壞過程中可能起主要作用。MMP家族在膽脂瘤骨質(zhì)破壞中可能的作用機(jī)制:①直接降解基底膜。基底膜是特化的細(xì)胞外基質(zhì),它形成皮膚上皮與深層基質(zhì)之間的一道屏障,其主要成分是Ⅳ型膠原,膽脂瘤對周圍骨質(zhì)的破壞必須突破基底膜。MMP家族是基底膜的主要降解酶,在炎癥較輕的膽脂瘤中,其基底膜的Ⅳ膠原分布呈連續(xù)性,而在炎癥較重的膽脂瘤中,其基底膜不連續(xù),缺乏Ⅳ型膠原的免疫反應(yīng)產(chǎn)物。②直接降解骨膠原。MMP家族屬于蛋白