高效提取物對樟子松枯梢病菌保護酶活性的影響

高效提取物對樟子松枯梢病菌保護酶活性的影響

樟子松是中國北方最重要的造林樹種，在生態(tài)和環(huán)境恢復方面發(fā)揮著重要作用。樟子松枯梢病是由松球殼菌Sphaeropsissapinea(Fr.)DykoetSutton引起的一種發(fā)病普遍、危害性大的世界性的傳染性病害?？萆也儆诩闹髦鲗圆『?對該類病害的控制應以提高寄主抗性及降低病原菌種群數(shù)量為主要方向。木霉菌Trichodermaspp.是自然界中資源豐富的拮抗微生物,具有抗菌譜廣、適應性強和多機制性的特點。首先,木霉菌競爭作用強,木霉菌還能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類物質(zhì),對多種病原菌有抑制作用。此外,它還具有重寄生作用,通過胞外酶破壞病原菌細胞壁,削弱病原菌的生長勢,甚至殺死病原菌,目前世界范圍內(nèi)已有以木霉為主要成分的生物殺菌劑,在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。同時,很多木霉種類對植物還具有促生抗逆的作用,通過定殖和次生代謝產(chǎn)物促進植物生長,提高植物抗病能力。篩選開發(fā)有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制劑產(chǎn)品,對保持樟子松林微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定、有效控制枯梢病的發(fā)生、減少化學農(nóng)藥的使用具有重要意義。本研究利用篩選獲得的高效木霉菌株T-43制備不同劑型菌劑進行了野外應用研究,為進一步研究木霉對松枯梢病菌的抑菌機理并開發(fā)穩(wěn)定的生物菌劑打下理論基礎。1材料和方法1.1森林微生物信息(1)木霉菌株:28株木霉。國外引進7株,課題組在國內(nèi)分離21株。上述菌株保存于東北林業(yè)大學森林微生物研究中心,菌株具體信息見表2。(2)病原菌株:樟子松枯梢病菌—松球殼菌Sphaeropsissapinea(Fr.)DykoetSutton,自遼寧省防風固沙研究所章古臺實驗林場樟子松人工林內(nèi)感病樟子松上分離,保藏于東北林業(yè)大學林學院森林微生物研究中心。1.2測試方法1.2.1生長和競爭系數(shù)采用平板對峙培養(yǎng)法。以單獨接種病原菌株和木霉菌株的平板作為對照,每處理3次重復。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每8h測量一次菌落半徑。計算各菌株生長被抑制率、木霉菌株相對抑制效果、木霉菌株生長速度,統(tǒng)計競爭系數(shù)。觀察是否有拮抗線產(chǎn)生,對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標準見表1。被抑制率(%)=(對照菌落直徑-對峙培養(yǎng)菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。1.2.2非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備和抑菌活性測定非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的制備:切取培養(yǎng)好的木霉菌餅3片接種到300mLPD培養(yǎng)基中,恒溫振蕩培養(yǎng)(25℃,150r/min)7d,過濾菌絲,取濾液分別與正己烷、乙酸乙酯和正丁醇按1:3體積比,靜置萃取2d后分液去除無機相,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機相。用濾液1/10體積的5%Tween80溶液溶解萃取物,同時將未萃取的發(fā)酵液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10,備用。抑菌活性測定:采用菌絲生長抑制法。將上述非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中,搖勻,使非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物終濃度達到20%。倒平板,接入病原菌,以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對照,25℃恒溫培養(yǎng)5d。采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑,計算各木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率,每處理3次重復。1.2.3保護酶活性的測定超氧化物歧化酶(SOD)是生物體中最重要的抗氧化酶,能夠催化生物氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基為O2和H2O2,保持細胞膜的結(jié)構和功能。過氧化氫酶(CAT)是一種以鐵卟啉為輔基的酶,能清除SOD的歧化產(chǎn)物H2O2為O2和H2O,避免某些具有生理功能的蛋白質(zhì)和巰基酶被氧化,喪失活性,對生物膜造成損傷。過氧化物酶(POD)是清除H2O2與許多有機氫過氧化物的抗氧化酶之一,它對H2O2非常專一。多酚氧化酶(PPO)也是植物重要的保護酶之一。本研究擬從提取物對病原菌保護酶系統(tǒng)中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性的影響角度,探討木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌機理。參考冀瑞卿、計紅芳的方法。將PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d的病原菌菌絲用無菌水洗凈后置于20mL含10%提取物的無菌水中,靜置。分別于2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h后取樣,測定菌絲保護酶活性,以10%吐溫80處理為空白對照。SOD、POD、CAT、PPO酶活測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。1.2.4藥物、試劑和儀器(1)試驗地概況:樟子松枯梢病野外防治基地設在遼寧省固沙所章古臺實驗林場的樟子松林內(nèi)。樟子松標準地建立于1985年,林齡25年,胸徑15cm,樹高15m,枯梢病發(fā)病率70%以上,適合進行生物防治。(2)野外應用時間:2010、2011年連續(xù)兩年進行防治。2010年以濃度梯度篩選試驗為主,2011年以對比試驗為主。對樟子松枯梢病的防治采用病害控制方式,病害控制時間選擇在樹木發(fā)病后。(3)菌劑制備:根據(jù)高效菌株篩選結(jié)果,采用國內(nèi)菌株T-C14和引進菌株T-43制備菌劑,進行野外應用研究。菌劑采用孢子粉劑和液體菌劑兩種。孢子粉劑的制作:將木霉孢子液加入菌糠培養(yǎng)基中,25℃恒溫培養(yǎng)7d后,用滅菌玻璃棒攪拌培養(yǎng)料,促進產(chǎn)孢。3d后收獲培養(yǎng)料,風干,過200目篩,制備孢子粉劑。其中菌株T-43孢子粉劑濃度為3.2×107g,菌株T-C14孢子粉劑濃度為1.7×107g,分裝后4℃保存?zhèn)溆?。液體菌劑的制作:將木霉孢子液接種于300mLPD培養(yǎng)基中,25℃恒溫震蕩培養(yǎng)7d,過濾去除菌絲,將發(fā)酵液與乙酸乙酯按1:3的比例(V/V)進行萃取,2d后分液去除無機相,將有機相進行減壓濃縮,后用5%的Tween80溶解制備液體菌劑。(4)菌劑施用方法:2010濃度梯度試驗:設定不同濃度梯度菌劑進行野外應用研究。菌劑為孢子粉劑和液體菌劑。濃度設定見表4每個濃度梯度防治20株樹,設3個重復,設定空白對照。采用樹冠噴霧的方式施藥。用藥時間為2010年7月10日、7月20日和7月30日。2010年9月調(diào)查病情指數(shù),利用SPSS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析,篩選最佳濃度梯度。2011對比試驗:以T-43為目標菌株制備孢子粉劑和液體菌劑進行野外應用研究。同時選用商品化的木霉分生孢子可濕性粉劑作為對照,濃度設定見表5。每個處理20株樹,設3個重復。菌劑施用時間為2011年7月10日、7月20日和7月30日。2011年9月調(diào)查病情指數(shù),利用SPSS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析,評價防治效果。病害損失估計采用分級計數(shù)法,以病情指數(shù)表示發(fā)病程度,病情指數(shù)計算:病情指數(shù)=[Σ(病級株數(shù)×代表數(shù)值)/株數(shù)總和×最重一級代表數(shù)值]×100。防治效果=(對照區(qū)感病指數(shù)-防治區(qū)感病指數(shù))/對照區(qū)感病指數(shù)×100%。2結(jié)果與分析2.1病原菌生長和誘導誘導生長各木霉菌株對病原菌株均有不同程度的抑制效果(表2)。對峙培養(yǎng)48h后,菌株T-C14、T-C33、T-43、T-19和T-28對病原菌生長抑制率均在50%左右,菌株生長速度較快,競爭系數(shù)高,在同病原菌對峙培養(yǎng)中,能迅速占領生態(tài)位,最終覆蓋病原菌,病原菌在木霉菌株的拮抗下幾乎停止生長。與木霉菌株接觸的病原菌株,其氣生菌絲開始逐漸稀疏甚至萎蔫。菌株T-19、T-C33能越過病原菌生長區(qū)域并逐漸將病原菌菌落覆蓋,菌株T-43、T-28和T-C14與病原菌之間形成明顯的拮抗線,并最終覆蓋病原菌。通過比較,引進木霉菌株優(yōu)勢明顯,菌株T-28、T-43對病原菌的相對抑制效果達到6以上,在抑制病原菌生長的同時,自身的生長幾乎沒有受到抑制,而是直接覆蓋病原菌,競爭系數(shù)最高。2.2高效抑菌試驗結(jié)果各菌株的各非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物及發(fā)酵原液對病原菌的生長均有不同程度的抑制效果(表3)。引進菌株中T-43抑菌效果最好,其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過90%;菌株T-28原液和菌株T-13原液的抑菌率分別超過81%和65%。病原菌在平板上菌絲稀疏,生長明顯變?nèi)跎踔敛簧L,被完全抑制。國內(nèi)菌株中,T-C33抑菌效果最好,其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超過76%;其次為菌株T-C14,其原液和正丁醇提取物的抑菌率均超過63%。同正己烷相比,正丁醇和乙酸乙酯萃取效果更好,而真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時,乙酸乙酯沸點更低,同原液相比,萃取后的代謝產(chǎn)物抑菌活性更強。在進一步的野外應用中,以乙酸乙酯為萃取劑進行大規(guī)模活性成分的提取制備。綜合對峙培養(yǎng)和抑菌試驗結(jié)果,選用引進菌株T-43作為防治枯梢病生物菌劑的出發(fā)菌株,制備孢子粉劑和液體菌劑進行野外應用研究。以國內(nèi)高效菌株T-C14作為對照,對比國內(nèi)外菌株對樟子松枯梢病的生物防治能力,評價應用效果。4種保護酶對木霉菌株T-43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物均比較敏感,在整個測試過程,都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖3~圖6),四種保護酶變化趨勢基本相同,對照組酶活基本處于緩慢2.4最佳劑量為3.4%、3.2細胞劑、3-10h率和4.3-羥基苯磺酸鈉t-4、5-特異分子10.連續(xù)兩年在樟子松枯梢病發(fā)病嚴重的遼寧省固沙所章古臺實驗基地樟子松人工林進行木霉菌劑野外應用研究結(jié)果顯示,不同濃度梯度的菌劑的防治效果存在顯著差異,其中引進菌株T43液體菌劑(10倍液)對樟子松枯梢病的控制效果超過94%,孢子粉劑(300倍液)控制效果超過上升的趨勢,處理組酶活在10-12h達到峰值,后迅速下降,48h后酶活幾乎為零。上述結(jié)果說明處理組菌體在提取物的逆境脅迫下,前期SOD、CAT、POD和PPO互相協(xié)調(diào)一致,呈現(xiàn)上升趨勢,來發(fā)揮它們對菌體的保護作用,后期由于氧自由基的增加和膜脂過氧化的加重,細胞透性增加,蛋白質(zhì)變性嚴重,最終導致各種酶含量的降低或消失,菌體死亡。68%。國內(nèi)菌株T-C14液體菌劑(10倍液)控制效果也超過78%,孢子粉劑(150倍液)控制效果超過63%,引進菌株對樟子松枯梢病的控制能力明顯好于國內(nèi)的高效菌株(表4)。2011年在確定菌劑最佳應用濃度的基礎上,選擇商品化木霉分子孢子可濕性粉劑作為對比。結(jié)果表明,T-43液體菌劑10倍液防治效果達到75%以上,分生孢子粉劑效果不理想,T-43分生孢子粉劑防治效果66.67%,對照(木霉分生孢子可濕性粉劑)防治效果72%,均低于T-43液體菌劑(表5)。3結(jié)論和討論3.1菌株的體外抗菌作用通過木霉菌株與病原菌株平板對峙培養(yǎng)研究、木霉菌株非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌活性研究,高效木霉菌株對病原菌保護酶活性的影響研究以及野外應用研究,得出以下結(jié)論:(1)引進菌株T-43和T-28對樟子松枯梢病菌具有顯著的拮抗作用。引進菌株T-43發(fā)酵液原液和乙酸乙酯提取物對病原菌抑制效果顯著。(2)引進菌株T-43乙酸乙酯提取物顯著降低病原菌保護酶(SOD、CAT、POD和PPO)活性,使病原菌氧自由基增加、膜脂過氧化的加重、細胞透性增加、蛋白質(zhì)變性嚴重,最終導致各種酶含量的降低或消失,菌體死亡。(3)菌株T-43液體菌劑10倍液對樟子松枯梢病具有顯著的控制效果。3.2菌株的生長和抗菌作用樟子松在我國很多地區(qū)廣泛分布,具有抗旱、抗逆性強的特點,為三北防護林工程和治沙工程建設的主要針葉造林樹種?？萆也∈且环N世界上廣泛發(fā)生的病害,該病主要發(fā)生于苗木和中老齡樹木上。樟子松枯梢病屬于寄主主導性病害,是多種生態(tài)因素長期協(xié)同作用的結(jié)果,屬于林木生態(tài)病害。單純的化學防治對該類病害很難奏效,而且會帶來一系列環(huán)境問題?；谖⑸鷳B(tài)調(diào)控的生物防治技術是通過人為引進高效拮抗菌株抑制病原菌,達到保持生態(tài)系統(tǒng)平衡,控制病害發(fā)生的目的。木霉菌作為普遍存在并具有豐富資源的拮抗微生物,在植病生防中具有重要的不可替代的地位。在土傳病害、葉部病害等的生物防治中發(fā)揮了重要的作用,并形成了多個商品化的品種,在生物農(nóng)藥中占據(jù)了重要的地位。木霉菌對病原菌的拮抗作用具有廣譜性的特點。但不同的種、同種的不同菌株都存在著拮抗活性的差異及拮抗對象種類上的差別。本研究對來自國內(nèi)外的28個木霉菌株進行了篩選。在對峙培養(yǎng)中,菌株T-43對樟子松枯梢病菌具有極強的拮抗和競爭作用,對峙培養(yǎng)2d,對病原菌的抑制率達到60.17%,相對抑制效果為6.05,在抑制病原菌生長的同時,自身的生長幾乎沒有受到抑制,而是直接覆蓋病原菌。筆者其它的試驗結(jié)果證明,菌株T-43對主要林木病原菌包括:樟子松枯梢病菌Sphaeropsissapinea、楊樹爛皮病菌Cytosporachrysosperma、楊樹葉枯病菌Alternariaalternata、沙棘干縮病菌Fusariumsporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctoniasolani、Fusariumoxysporum、Pythiumdebaryanum均有明顯的拮抗作用,說明該菌是適應性較強的廣譜性拮抗菌,在病害生物防治中具有廣闊的應用開發(fā)前景。高克祥對楊樹潰瘍病的高效拮抗木霉進行了篩選,其中哈茨木霉T-88和深綠木霉T-95對楊樹爛皮病菌Cytosporachrysosperma和楊樹水泡潰瘍病菌Dothiorellagregaria的抑制率可以達到60%以上,與本文篩選的高效菌株相似。T-43同時具有重寄生作用,通過對峙菌落的顯微觀察,T-43對樟子松枯梢病菌具有明顯的重寄生作用,T-43產(chǎn)生附著胞或者鉤狀分枝吸附于病原菌的菌絲上,使病原菌菌絲斷裂死亡,該結(jié)果與Chet的觀察結(jié)果一致。研究證明,木霉菌的次生代謝產(chǎn)物豐富,可產(chǎn)生揮發(fā)或不揮發(fā)性的抗生素類物質(zhì),如木霉菌素(trichodermin)、膠毒素(gliotoxin)、膠綠木霉素(glioviridin)、綠色菌素(viridin)和抗菌肽(antibioticpeptide)以及揮發(fā)性抗菌素等。該功能可以與其它的生防作用機制(競爭作用、重寄生作用、胞壁降解酶等)發(fā)揮協(xié)同增效作用,達到抑制病原的目的,同時對植物具有促生