香山黃枯萎病菌的分離與鑒定

香山黃枯萎病菌的分離與鑒定

北京香山是中國著名的風(fēng)景如畫的地方。作為首都秋天的“著名風(fēng)景”，每年吸引數(shù)百萬名國內(nèi)外游客。黃櫨(Cotinuscoggygriavar.cinerea)是構(gòu)成香山紅葉景觀的主體樹種,其葉片秋季變紅,色澤鮮艷,木材可提取黃色染料,并可制作家具或用于雕刻,樹皮和葉可提制栲膠,枝葉入藥有消炎、清熱之功效,是一種綜合利用價值極高的木本植物?？菸∈窍闵郊t葉的主要病害,不僅嚴(yán)重影響紅葉景觀,甚至?xí)?dǎo)致植株枯萎死亡,而至今鮮有有效的防治方法,逐漸引起社會的廣泛關(guān)注。某些絲狀真菌是導(dǎo)致黃櫨枯萎病的主要病原體,本研究進(jìn)行了黃櫨枯萎病葉的真菌分離與鑒定,希望為黃櫨枯萎病的防治奠定微生物生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。1組織分離和pcr檢測1.1植物材料黃櫨葉片于2013年8月采自北京香山公園平均3年樹齡的黃櫨植株(圖1,見封四),具體位置為東經(jīng)116.19°,北緯39.99°,海拔181m。采集樣品于4℃條件下保存。1.2培養(yǎng)基及試劑玫瑰紅鈉和PDA成品培養(yǎng)基,購自北京陸橋公司;基因組DNA快速提取試劑盒及PCR相關(guān)試劑,購自TIANGEN公司;PCR引物,由上海生工生物工程有限公司合成。1.3枯萎病葉片寄生真菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)觀察稱取2g發(fā)病葉片,無菌水沖洗2次,用無菌剪刀剪碎葉片,于無菌研缽中加入少量滅菌的石英砂和碳酸鈣及少量無菌水研磨,然后依次用無菌水稀釋成濃度為10-1g/mL、10-2g/mL、10-3g/mL的組織懸液。分別取100μL懸液涂布于玫瑰紅鈉平板上(平板含有25mg/mL氯霉素和25mg/mL四環(huán)素),每個處理3個平行。玫瑰紅鈉平板置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),從第2天開始對平板上的單菌落進(jìn)行分離計(jì)數(shù),共7d,根據(jù)菌落形態(tài)(包括大小、形狀、顏色、質(zhì)地、有無滲透液,有無可溶性色素等),對可培養(yǎng)真菌進(jìn)行初篩,利用PDA培養(yǎng)基平板純化菌株。純化好的菌株,利用試管保存?zhèn)浞?并提交給中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)保存。1.4枯萎病葉片寄生真菌的分子生物學(xué)鑒定利用基因組DNA提取試劑盒提取真菌基因組DNA,采用通用引物:ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增ITSrDNA序列,到種或?qū)偎借b定;Bt2a(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′)和Bt2b(5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGG-C-3′)擴(kuò)增微管蛋白基因序列,到種水平鑒定。PCR反應(yīng)體系為:模板10×PCRbuffer5μL、dNTP(2.5mmol/L)4μL、模板2μL、TaqDNA聚合酶1μL、引物各1μL,補(bǔ)充去離子水至50μL。反應(yīng)條件:94℃5min;94℃50s,55℃50s,72℃50s,33個循環(huán);72℃7min。PCR產(chǎn)物用1%凝膠電泳進(jìn)行檢測并送交上海生工生物工程有限公司測序。將序列信息提交至GenBank,獲得序列登錄號為KF746056—KF746064,并將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析,以確定與已知序列的同源關(guān)系。采用CLUSTALX1.83進(jìn)行多序列比對,并利用NJ法通過MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹及分子進(jìn)化分析。2菌體及真菌生物學(xué)特性2.1寄生真菌分離結(jié)果與形態(tài)觀察真菌分離結(jié)果中未得到酵母菌株,共分離到霉菌22株,形態(tài)觀察將其分為4類。菌株形態(tài)描述及其CICC編號見表1,形態(tài)照片見圖2(見封四)。2.2寄生真菌分子生物學(xué)分析通過構(gòu)建ITSrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析(見圖3),4類霉菌隸屬于4個屬。ITSrDNA序列NCBI比對結(jié)果見表2。菌株HL6通過微管蛋白基因(β-tubulin)測序分析,Blast最高相似性種為Penicilliumoxalicum(KC344993)。3植物枯渙病葉主要增加植物的分離鑒定黃櫨枯萎病嚴(yán)重影響香山紅葉美景,甚至?xí)斐蓸淠究萃?自20世紀(jì)80年代至今尚未實(shí)現(xiàn)有效防治。目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)絲狀真菌是植物枯萎病的主要致病因子[5~8],對其系統(tǒng)分離與準(zhǔn)確鑒定是開展防治工作的基礎(chǔ)和前提。本研究直接對香山黃櫨枯萎病葉的真菌進(jìn)行分離鑒定,結(jié)果共得到4種絲狀真菌,其中細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)為優(yōu)勢種,其存在于多種植物病原葉片上,寄主植物種類較為廣泛;草酸青霉(Penicilliumoxalicum)通常存在于一些枯枝落葉上,為植物枯萎病葉的主要寄生菌;臘梅擬莖點(diǎn)霉(Phomopsischimonanthi)主要危害臘梅科植物枝條,引起枝枯,屬首次在黃櫨樹種上分離到;葡萄莖枯病菌(Phomaglomerata)作為一種小麥病原菌,能引起植物落葉和腐爛。基于本研究的分離與鑒定結(jié)果,并參考這些絲狀真菌致病性相關(guān)研究報(bào)道,能夠說明上述4種真菌菌株有可能作為黃櫨葉片的潛在致病菌,而關(guān)于其致病機(jī)理與防治方面的研究與實(shí)踐還需要進(jìn)一步開展與實(shí)施。4寄生蟲真菌的分離和鑒定本研究通過微生物培養(yǎng)分離方法,結(jié)合核酸序列和形態(tài)學(xué)比對手段,從香山黃櫨枯萎病葉分離到4種絲狀真菌,并分別鑒定為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)、臘梅擬莖點(diǎn)霉(Phomopsischimonanthi)和葡萄莖枯病菌(Phomaglomerata)。此4種真菌首次在黃櫨枯萎病研究中分離到,其中細(xì)極鏈格孢和臘梅擬莖點(diǎn)霉為優(yōu)勢菌種,且為已報(bào)道的植物病原菌,可能為香山黃櫨枯萎病潛在的病原菌。2.3寄生真菌的鑒定結(jié)果通過形態(tài)學(xué)比對和分子序列系統(tǒng)發(fā)育分析,分離到的22株寄生真菌被鑒定為4種,分別為細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、草酸青霉(Peni