融合蛋白柔性linker的選擇

融合蛋白柔性linｋer的選擇————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:蛋白融合Linkeｒ的設(shè)計與選擇接頭序列(Linkｅr)設(shè)計是基因融合技術(shù)能否成功的核心技術(shù)之一。即通過一段適宜的核苷酸序列將不同的目的基因連接起來,使其在適宜的生物體內(nèi)體現(xiàn)成為一條單一的肽鏈,其中起連接作用的氨基酸稱為Lｉｎｋeｒ[1］。融合蛋白中的兩種成分能否分別形成對的的空間構(gòu)造、更加好的發(fā)揮生物學(xué)活性,與連接融合蛋白中兩種成分的接頭序列親密有關(guān)。重組生成的融合蛋白規(guī)定插入融合蛋白中的ｌinｋeｒ不能影響目的蛋白各自的功效。因此，Liｎkｅr序列的設(shè)計和選擇對融合基因的構(gòu)建至關(guān)重要。針對Lｉnker序列的設(shè)計和選擇己有諸多有關(guān)的研究[2]。現(xiàn)在的研究重要有兩種,即螺旋形式的Lｉnker肽如［Ａ(EAAＡK)nA]和低疏水性、低電荷效應(yīng)的氨基酸構(gòu)成的接頭,后來者應(yīng)用較廣泛。這種低疏水性、低電荷效應(yīng)的氨基酸構(gòu)成的多肽接頭能夠充足伸展以分開兩種融合的組分,使之能在互不干擾的狀況下充足折疊成各自的天然構(gòu)象。Ryｏiｃhi等[3］在兩種不同功效的融合蛋白之間插入了不同類型的linkｅｒ序列,涉及可形成螺旋狀的不同長度的肽鏈、柔性liｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。成果發(fā)現(xiàn)螺旋狀的ｌinker同柔性linｋeｒ及ＰA同樣，能夠有效的將融合蛋白的兩個構(gòu)造域分開,甚至可增強(qiáng)融合蛋白的功效。Linkeｒ的長度是融合基因構(gòu)建的又一種重要的因素。如果Linkeｒ的長度過長，則使融合蛋白對蛋白酶比較敏感,造成活性融合蛋白在生產(chǎn)過程中的產(chǎn)量下降;應(yīng)用較短的Ｌiｎker,能夠克服重組蛋白酶分解的問題,但可使兩個融合分子相距太近造成蛋白功效的喪失。Lｉnker的長度不應(yīng)不大于３.5ｎm,這是由于相鄰肽鍵的距離為0.３8nｍ,因此連接肽最少應(yīng)包含10個氨基酸?，F(xiàn)在最為慣用的是Hｕstｏn設(shè)計合成的（GGGGS)3序列。研究發(fā)現(xiàn),連接肽為（Gly4Ser）３的融合蛋白體現(xiàn)出較高的復(fù)性效率。這可能是(Gly4Ser)3連接肽較長且柔軟,在復(fù)性時能夠減少融合蛋白的兩組份間的空間位阻,從而更有助于融合蛋白各個構(gòu)造域的對的折疊。因此,Linkｅr的長度不能過長也不能過短。Linkｅr的選擇,還應(yīng)考慮Linkｅr內(nèi)部的氨基酸序列,研究發(fā)現(xiàn),Linkｅｒ構(gòu)成相似但序列不同時,構(gòu)建的融合蛋白的穩(wěn)定性存在明顯差別;編碼Ｌinkeｒ的核苷酸構(gòu)成,調(diào)節(jié)編碼Lｉｎｋｅr的核苷酸構(gòu)成,雖不變化原接頭Ｌinker的氨基酸序列,但融合蛋白的體現(xiàn)存在明顯差別。Ｌiｎｋｅr序列中有太多的α螺旋和β角構(gòu)造會限制融合蛋白的伸縮性,進(jìn)而影響融合蛋白的生物學(xué)活性。總之,Lｉnker的選擇不是一成不變的,而要根據(jù)融合蛋白分子的大小和特性來決定。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一大類多功效、高活性的生物物質(zhì)。它在介導(dǎo)機(jī)體多個免疫反映及對各類免疫活性細(xì)胞的分化、發(fā)育和活化中起著十分重要的作用。細(xì)胞因子融合蛋白（cyｔokinefusｉｏｎprotein)技術(shù)是當(dāng)今免疫學(xué)研究的一種熱點(diǎn)方向。該辦法是基于這些細(xì)胞因子含有相似或有關(guān)的功效活性而各自作用靶點(diǎn)不同,運(yùn)用基因工程技術(shù)將兩種或多個細(xì)胞因子融合在一起,其融合基因體現(xiàn)產(chǎn)物既含有其構(gòu)成因子獨(dú)特的生物學(xué)活性或使其某些活性明顯提高,還可能會通過生物學(xué)活性的互補(bǔ)及協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮出較單一細(xì)胞因子簡樸配伍所不含有的復(fù)合生物學(xué)功效,甚至還可能會產(chǎn)生某些新的構(gòu)造及生物學(xué)功效，這種新型的人工蛋白含有極高的應(yīng)用價值和良好的發(fā)展前景。早在１986年Ｓeno等用含ＥｃoＲI的12個核苷酸（４肽)CCGGAＡTＴCＡTG為接頭,將IＦNγ和IＬ2片段加以連接,成果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的融合蛋白含有ＩFNγ與ＩＬ２的雙重活性。迄今為止,國內(nèi)外已相繼報道了多個有價值的細(xì)胞因子融合蛋白?，F(xiàn)就細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)的原則、構(gòu)建類型、應(yīng)用現(xiàn)狀以及發(fā)展前景做一簡要概述。1細(xì)胞因子蛋白融合技術(shù)1.1蛋白融合的構(gòu)建原則基因工程構(gòu)建細(xì)胞因子融合蛋白須滿足下列幾個條件:(1)各融合分子的目的DＮA片段置于同一套調(diào)控序列(涉及啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合序列、終止子等)的控制之下。(2）融合分子間須以富含疏水性氨基酸的接頭Linｋｅｒ連接,同時也要考慮接頭序列的長度和核苷酸、氨基酸的構(gòu)成、排列次序等因素。如融合蛋白內(nèi)部接頭的不同,可造成融合蛋白各部分化學(xué)構(gòu)造的變化,而影響到各融合分子的空間構(gòu)象，造成其生物學(xué)活性差別。因此,設(shè)計肽鏈之間的接頭時，要盡量不影響兩端蛋白的HYPERLＩNK""自然折疊，使各融合成分互不干擾。（３)為了確保融合蛋白的生物學(xué)活性,還需考慮構(gòu)成融合蛋白各成分本身的特性及其互相作用機(jī)制。如腫瘤壞死因子(TNF）和α干擾素(ＩFNα)在克制腫瘤細(xì)胞、增強(qiáng)抗病毒活性等方面有協(xié)同作用。有學(xué)者構(gòu)建了TNF和IFNα的融合蛋白,但發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的抗病毒和抗腫瘤活性與單獨(dú)應(yīng)用TＮF和ＩFNα相比,抗病毒活性減少24倍,抗腫瘤活性減少15倍，與構(gòu)建融合蛋白的初衷相背。分析因素，可能是這兩種細(xì)胞因子的理化性質(zhì)差別較大,IＦNα活性穩(wěn)定,而TNＦ活性極易喪失,其融合蛋白在一定程度上影響了彼此的活性。1．2蛋白融合Liｎｋeｒ的設(shè)計與選擇接頭序列（Lｉnker）設(shè)計是基因融合技術(shù)能否成功的核心技術(shù)之一。即通過一段適宜的核苷酸序列將不同的目的基因連接起來，使其在適宜的生物體內(nèi)體現(xiàn)成為一條單一的肽鏈,其中起連接作用的氨基酸稱為Ｌiｎｋer[1]。融合蛋白中的兩種成分能否分別形成對的的空間構(gòu)造、更加好的發(fā)揮生物學(xué)活性,與連接融合蛋白中兩種成分的接頭序列親密有關(guān)。重組生成的融合蛋白規(guī)定插入融合蛋白中的linｋｅｒ不能影響目的蛋白各自的功效。因此,Liｎkｅr序列的設(shè)計和選擇對融合基因的構(gòu)建至關(guān)重要。針對Lｉnkeｒ序列的設(shè)計和選擇己有諸多有關(guān)的研究[２]。現(xiàn)在的研究重要有兩種,即螺旋形式的Ｌｉnker肽如［A(EAAＡＫ)nＡ]和低疏水性、低電荷效應(yīng)的氨基酸構(gòu)成的接頭,后來者應(yīng)用較廣泛。這種低疏水性、低電荷效應(yīng)的氨基酸構(gòu)成的多肽接頭能夠充足伸展以分開兩種融合的組分，使之能在互不干擾的狀況下充足折疊成各自的天然構(gòu)象。Ryoichi等［３]在兩種不同功效的融合蛋白之間插入了不同類型的linker序列,涉及可形成螺旋狀的不同長度的肽鏈、柔性ｌiｎkｅr以及葡萄糖球菌蛋白Ａ(PA)。成果發(fā)現(xiàn)螺旋狀的linker同柔性ｌｉnｋer及PＡ同樣,能夠有效的將融合蛋白的兩個構(gòu)造域分開,甚至可增強(qiáng)融合蛋白的功效。Ｌiｎker的長度是融合基因構(gòu)建的又一種重要的因素。如果Linkｅｒ的長度過長,則使融合蛋白對蛋白酶比較敏感,造成活性融合蛋白在生產(chǎn)過程中的產(chǎn)量下降;應(yīng)用較短的Ｌinkｅｒ,能夠克服重組蛋白酶分解的問題,但可使兩個融合分子相距太近造成蛋白功效的喪失。Linｋｅr的長度不應(yīng)不大于3．５nm,這是由于相鄰肽鍵的距離為０.３8nm,因此連接肽最少應(yīng)包含１0個氨基酸?，F(xiàn)在最為慣用的是Huｓton設(shè)計合成的(GGＧGS)3序列。研究發(fā)現(xiàn),連接肽為（Glｙ４Sｅr)３的融合蛋白體現(xiàn)出較高的復(fù)性效率。這可能是(Glｙ4Seｒ）3連接肽較長且柔軟，在復(fù)性時能夠減少融合蛋白的兩組份間的空間位阻,從而更有助于融合蛋白各個構(gòu)造域的對的折疊。因此，Lｉnker的長度不能過長也不能過短。Linker的選擇,還應(yīng)考慮Linker內(nèi)部的氨基酸序列,研究發(fā)現(xiàn),Linkｅr構(gòu)成相似但序列不同時,構(gòu)建的融合蛋白的穩(wěn)定性存在明顯差別;編碼Linker的核苷酸構(gòu)成,調(diào)節(jié)編碼Linｋeｒ的核苷酸構(gòu)成,雖不變化原接頭Linkｅr的氨基酸序列,但融合蛋白的體現(xiàn)存在明顯差別。Ｌｉnｋer序列中有太多的α螺旋和β角構(gòu)造會限制融合蛋白的伸縮性,進(jìn)而影響融合蛋白的生物學(xué)活性?？傊?Ｌinker的選擇不是一成不變的,而要根據(jù)融合蛋白分子的大小和特性來決定。2細(xì)胞因子融合方式及其應(yīng)用根據(jù)細(xì)胞因子融合分子的不同,可把細(xì)胞因子融合蛋白大致分成下列幾類:２．１不同或相似細(xì)胞因子的融合蛋白細(xì)胞因子含有多功效性和通用性,其作用的靶點(diǎn)各有不同。運(yùn)用細(xì)胞因子的這一特點(diǎn),能夠通過基因融合技術(shù)創(chuàng)制出更佳的細(xì)胞因子融合蛋白,其融合基因體現(xiàn)產(chǎn)物很可能體現(xiàn)出雙因子簡樸配伍所沒有的復(fù)合功效，并且有可能會增強(qiáng)各個組份間的協(xié)同作用。IL3和GMCSF均為造血刺激因子,它們對不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞均含有促增殖和分化的作用,且共用受體β鏈。鑒于兩者功效互補(bǔ),Curtis等于1991年構(gòu)建并報道了第一種由不同細(xì)胞因子構(gòu)成的融合蛋白人ＧMCＳF/IＬ3和IL3／GMCＳF融合蛋白,分別稱為PｌＸY321和ＰIＸY344。為確保其各自的天然構(gòu)象，在ＧMＣSＦ與ＩL３兩者之間均引入了一段疏水氨基酸序列,從而確保其與受體的結(jié)合。體外受體結(jié)合實驗證明，PIXY3２１與只體現(xiàn)IL3受體的ＪM1細(xì)胞株或只體現(xiàn)GMCSＦ的HL6０細(xì)胞株結(jié)合時其親和力比單體略高,闡明該融合蛋白可經(jīng)IL3、ＧMCSF構(gòu)造域與其各自的受體結(jié)合。同時,PIＸＹ3２1對AML1９3細(xì)胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明顯高于單獨(dú)使用IL3、GＭCSF或IL３加GMCSＦ的作用,其作用可提高5~10倍。IL２、IL６是兩個含有多個免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。19９2年Ferｎａd等構(gòu)建了兩個人IL2／IＬ6融合基因,目的在于構(gòu)建體現(xiàn)一種含有雙重功效的免疫調(diào)節(jié)因子,實驗表明融合蛋白與野生型ＩL2的活性一致，較IＬ6活性中度下降。出現(xiàn)此成果的因素可能是由于局部構(gòu)象的變化或者是IL2與ＩL6之間的互相作用干擾所致。體外進(jìn)一步研究表明，該融合蛋白既可誘導(dǎo)Ｔ、B細(xì)胞體現(xiàn)IL2R和ＩＬ６Ｒ,并且還可作為分子橋梁增進(jìn)和穩(wěn)定Ｔ、Ｂ細(xì)胞間的互相作用。國內(nèi)的趙春華等也構(gòu)建和高效體現(xiàn)了含有增進(jìn)細(xì)胞集落形成、增進(jìn)LＡＫ的增殖作用的IL２/IL6融合蛋白。將兩種相似的細(xì)胞因子融合在一起也能夠起到明顯的生物學(xué)功效。馬大龍等構(gòu)建了人雙體IL6、雙體IL3融合蛋白，研究表明雙體IＬ６與單體IL6在生物學(xué)活性上差別不大,但雙體IL3對人骨髓細(xì)胞的集落刺激作用明顯高于單體IL3的作用。ＩL7是T、Ｂ淋巴細(xì)胞成熟分化過程中重要的細(xì)胞因子,能夠增強(qiáng)成熟T細(xì)胞的增殖及其功效,并有增進(jìn)CTL增殖、分化并加強(qiáng)其殺傷活性,刺激LAK細(xì)胞活性的能力。Lai等[4]用一段柔性接頭將IL7和人肝細(xì)胞生長因子β片段(ｈepaｔｏｃyｔｅgrowthfactｏｒbeta2chaｉn，HGFbeta）連接,成果發(fā)現(xiàn)融合蛋白能選擇性的高效刺激B祖細(xì)胞系的增殖。胰島素樣生長因子(IＧF）常與其它生長因子一起發(fā)揮協(xié)同作用,是最佳的二聯(lián)細(xì)胞因子融合蛋白的備選因子。IGFＩＩ可刺激多個組織中細(xì)胞的增殖或分化。將IGFII與一段信號肽以及胰島素樣的昆蟲激素boｍyxｉｎ的N端序列融合體現(xiàn),便可得到分泌形式的含有生物活性的BＯMIGF。Ｄifalｃo等制備了一種ＢOＭIGF和IＬ３的融合蛋白，體外實驗中它可刺激正常外周血細(xì)胞中的骨髓干細(xì)胞集落形成,體內(nèi)實驗成果亦顯示該融合蛋白能動員含有高度增殖活性的骨髓干細(xì)胞進(jìn)人外周血，進(jìn)而定居至脾臟而發(fā)揮造血功效。2.2細(xì)胞因子與其受體的融合蛋白細(xì)胞因子與其受體結(jié)合時,可增進(jìn)其與其它有關(guān)分子的結(jié)合,進(jìn)而提高其生物學(xué)活性的發(fā)揮。IL6在肝細(xì)胞的增殖中起著增強(qiáng)作用。IＬ６和ＩL6Ra(ｇp80)的結(jié)合使其易于和另一種受體IL６Rβ（ｇp１3０)結(jié)合。可溶性IＬ６R蛋白(sIＬ６R）與IL6結(jié)合后,靶細(xì)胞對IＬ６的敏感性增高,并可使僅體現(xiàn)膜結(jié)合型IＬ６R的細(xì)胞(IL６Rа/gp1３0）對IL６起反映。在sＩL6Ｒ/IL6雙基因轉(zhuǎn)染的小鼠中,sIL6R發(fā)揮錨定IL6的作用,延長血漿ＩＬ6半衰期,同時細(xì)胞對IＬ6的敏感性明顯提高。Bcl2蛋白家族是細(xì)胞程序性死亡的重要調(diào)節(jié)因子,BclXＬ是Bcl２蛋白家族中的重要組員之一,它能在多個類型的細(xì)胞上克制由多個刺激所誘發(fā)的細(xì)胞死亡。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCＳF)含有刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落增加的能力,其功效的發(fā)揮依賴于它與GMCSＦ特異性受體的結(jié)合。Ａntｏnelｌa等［5]將人GMCSＦ與ＢclＸＬ蛋白融合,該融合蛋白可與人單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞的上的GMCSＦ受體結(jié)合誘導(dǎo)其增殖,并使ＢclXL進(jìn)入細(xì)胞克制細(xì)胞的死亡,加速細(xì)胞的增殖。2．3細(xì)胞因子與抗原融合蛋白某些細(xì)胞因子能夠招募抗原提呈細(xì)胞(AＰC）,增進(jìn)APＣ的成熟和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功效，從而提高機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答。因此,人們通過基因融合技術(shù),將細(xì)胞因子與抗原融合，使其更加好的發(fā)揮基因佐劑作用。腫瘤細(xì)胞體現(xiàn)的免疫球蛋白(獨(dú)特型,Id）能夠作為腫瘤特異性抗原,在Ｂ細(xì)胞淋巴瘤中已證明用免疫球蛋白的可變區(qū)（即獨(dú)特型)免疫動物,可保護(hù)動物免受隨即的腫瘤攻擊。Taｏ等從B淋巴瘤細(xì)胞(38C13）分離出Ｉd,將其與GMＣＳＦ基因融合,構(gòu)建了Ｉｄ與GMCSF融合蛋白，Id的免疫原性明顯增強(qiáng),可誘導(dǎo)出含有抗腫瘤作用的特異性抗Id抗體。隨即Chen等又構(gòu)建了ＩdIL２和IｄIL4兩種融合蛋白,均含有比較高的免疫原性。用IdIL２融合蛋白進(jìn)行免疫可產(chǎn)生高滴度的抗獨(dú)特型抗體IgG2a和lｇＧ3,而IdIL４和IｄGMCSＦ融合蛋白則無此作用。這3種融合蛋白都能誘導(dǎo)抗獨(dú)特型抗體的產(chǎn)生，且不需要載體蛋白和佐劑。楊登科等[６]構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌的Ag８５B和IL2嵌合基因疫苗,研究發(fā)現(xiàn)該融合蛋白含有Ag85B和IL2的雙重功效活性,兩者融合后產(chǎn)生協(xié)同作用,在體外增進(jìn)了外周血單核細(xì)胞的增殖和Ｔｈ1型細(xì)胞因子的分泌。Hｉｔoｋi等[7]構(gòu)建了IL1２和鼠疫耶爾森菌Ｆ1V融合蛋白(IＬ12/F1V,莢膜蛋白抗原(F１Ag）,毒力抗原(VAｇ))共體現(xiàn)基因疫苗,研究發(fā)現(xiàn),用肺鼠疫攻毒后,ＩＬ12(低體現(xiàn)）/Ｆ1V相比IL１2(低體現(xiàn))/F1、IL12(低體現(xiàn))／V和ＩＬ12(低體現(xiàn))/載體(vecｔor）DＮA疫苗而言,80%的小鼠獲得保護(hù)。Ｍark等[8]構(gòu)建了豚鼠髓脂質(zhì)堿性蛋白(guｉｎｅapigmyelｉnbａｓicproｔeiｎ,GPＭBP;neｕrｏantiｇeｎorNAg)的重要致腦炎肽和白細(xì)胞介素16（ＩL１６)融合蛋白,研究發(fā)現(xiàn)該融合蛋白是路易鼠實驗性本身免疫性腦脊髓炎的有效克制劑并證明IL16是研制致耐受性疫苗的最佳候選細(xì)胞因子。細(xì)胞因子與抗原融合產(chǎn)生的佐劑效應(yīng),可能比游離的細(xì)胞因子產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)含有更多的優(yōu)點(diǎn)。因而,在疫苗研究中,細(xì)胞因子作為免疫佐劑越來越受到人們的重視。2.4細(xì)胞因子與抗體融合蛋白將抗體分子的片段與細(xì)胞因子融合，該融合蛋白不僅結(jié)合了抗體與抗原特異性結(jié)合的特性,還含有細(xì)胞因子的多功效活性,從而可借助抗體將細(xì)胞因子導(dǎo)向到特定的靶部位,使其高效發(fā)揮生物學(xué)功效，減輕全身毒副作用。IL2是免疫反映的重要介導(dǎo)分子,也是重要的抗腫瘤細(xì)胞因子之一。在體外，IＬ2可促使細(xì)胞毒性Ｔ細(xì)胞、NK細(xì)胞及輔助T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子,誘導(dǎo)ＬＡＫ細(xì)胞增殖?？贵wIL2融合蛋白可將ＩL2靶向腫瘤灶,提高腫瘤局部IＬ２的濃度，從而達(dá)成更加好的抗腫瘤效應(yīng),同時也有助于減輕IL２的毒性。Heｕseｒ等構(gòu)建了抗黏蛋白的scFvFｃIL2融合蛋白(C595scFvFcIL2）,實驗表明此融合蛋白能同時特異性地結(jié)合MＵCI+的腫瘤細(xì)胞和ＣD25+的免疫效應(yīng)細(xì)胞。體外實驗還發(fā)現(xiàn)，該融合蛋白能刺激活化的T細(xì)胞增殖,介導(dǎo)靜息的NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。在免疫重建的SCID鼠黑色素瘤肝、肺轉(zhuǎn)移瘤模型中,腫瘤特異性的融合蛋白Ch２２5IL2和Cｈ１4.18IL2可克制轉(zhuǎn)移灶的生長，甚至在注射腫瘤細(xì)胞后8d，腫瘤己形成狀況下,也能完全消退微轉(zhuǎn)移病灶。該研究表明借助抗體將細(xì)胞因子導(dǎo)向到腫瘤部位的免疫治療辦法可有效對抗人類黑色素瘤的播散。Reinaｒtz等將IL6與抗獨(dú)特型單克隆抗體重組,制備了chＡＣA１25IL6融合蛋白并將其用于卵巢癌的研究。小鼠抗獨(dú)特型單抗ＡCA125模擬卵巢癌細(xì)胞上的CA１２5抗原，可誘導(dǎo)抗－抗獨(dú)特型抗體反映,該反映與卵巢癌患者生存時間呈正有關(guān)。實驗成果表明:融合蛋白接種后抗CA12５(Ab3）的濃度較ＩＬ6與ｃhACA聯(lián)用高,且未觀察到抗人IL6抗體的產(chǎn)生,而聯(lián)用狀況下能夠檢測到抗人IL6抗體產(chǎn)生。IＬ１2是介導(dǎo)先天免疫及細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞因子,含有很強(qiáng)的克制腫瘤及制止腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。在體外，ＩL12對于腫瘤細(xì)胞沒有直接的作用,但I(xiàn)Ｌ１2能激活T細(xì)胞及NK細(xì)胞，刺激CＤ4＋T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，后者產(chǎn)生的細(xì)胞因子可激活ＣTＬ和巨噬細(xì)胞。IL1２也是血管形成的強(qiáng)效克制劑,可通過誘導(dǎo)IFNγ等的分泌克制血管形成,進(jìn)而克制體內(nèi)腫瘤的生長。纖連蛋白（fibｒonｅcｔin,FN）為一種高分子量多功效糖蛋白，是血管形成的標(biāo)志，重要聚集于新生血管的周邊,在腫瘤的浸潤事件中起重要作用。Haliｎ等采用抗ＦＮ的ｓｃFｖL19與IL12融合，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白含有強(qiáng)大的抗腫瘤活性,可造成腫瘤組織中的T細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤。另外，在鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型中證明,應(yīng)用該融合蛋白治療比應(yīng)用等量的IＬ12含有更強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)。GＭCSＦ能刺激造血細(xì)胞的增殖及分化,也是一種多功效的免疫調(diào)節(jié)因子。GMCＳF能提高多個ＡPC的抗原提呈及增進(jìn)單核細(xì)胞體現(xiàn)ＭHCII類分子、粒細(xì)胞體現(xiàn)黏附分子及刺激T細(xì)胞增殖。動物實驗證明,注射GMCSF后,通過增強(qiáng)T細(xì)胞免疫,能提高抗腫瘤疫苗的保護(hù)效應(yīng)。Hｅｌguerａ等將鼠GMCＳF與HＥR2抗體融合,觀察到該融合蛋白既保持了與人HER2/neu抗原的特異性結(jié)合能力,同時也保持了與重組鼠ＧMＣSF相似的生物學(xué)活性，在小鼠體內(nèi)能夠明顯克制體現(xiàn)ＨEＲ2/ｎeu的腫瘤細(xì)胞生長,能同時增強(qiáng)Th1和Ｔh２型細(xì)胞的免疫應(yīng)答。2．５細(xì)胞因子與毒素融合蛋白細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白是以細(xì)胞因子取代毒素分子的識別區(qū)域,使毒素蛋白能選擇性地殺傷含有對應(yīng)細(xì)胞因子受體的靶細(xì)胞,從而達(dá)成治療那些細(xì)胞因子引發(fā)病理性作用的疾病,如本身免疫性疾病、移植排斥反映等。腫瘤細(xì)胞因其惡性增殖、缺少接觸克制的特性,不同腫瘤細(xì)胞都有其異于正常組織細(xì)胞的受體特性，將細(xì)胞因子與毒素蛋白融合,可運(yùn)用細(xì)胞因子作為靶向載體將細(xì)胞毒素運(yùn)輸?shù)侥[瘤微環(huán)境,使該融合蛋白能選擇性殺傷含有對應(yīng)細(xì)胞因子受體的靶細(xì)胞，實現(xiàn)靶向腫瘤的治療作用。白喉毒素含有高效的細(xì)胞毒性,運(yùn)用其與不同的目的基因融合成的多個毒素復(fù)合物,可對體現(xiàn)某些特異性受體或蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,特別是某些腫瘤細(xì)胞。體外實驗表明，白喉毒素ＩＬ2的融合蛋白(DAＢ3８9ＩL2)對體現(xiàn)高親和力IL2受體的細(xì)胞株起毒性作用,而缺少完整的高親和力受體的細(xì)胞株(有p55亞單位而無p75亞單位）則對該融合毒素相對耐受。Saleh等報道ＤAB3８９IＬ2在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cuｔａneｏusTcelｌｌｙｍphoma,CTCＬ）Ⅰ期臨床實驗中單獨(dú)使用顯示出明顯的臨床治療效果。ＤAB3８９IL2已成為美國食品與藥品管理局(FDA)同意的臨床治療藥品。張建新等基于骨髓瘤、原發(fā)性肝癌等腫瘤細(xì)胞表面ＩL6受體可過分體現(xiàn)的事實，用IL6cDNA取代白喉毒素的受體結(jié)合區(qū)，構(gòu)建體現(xiàn)了白喉毒素/ＩL6融合蛋白。研究表明,此種融合蛋白對表面有大量IL6受體的骨髓瘤細(xì)胞(U26６）有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用而IL6受體較少的正常細(xì)胞對其有一定的耐受性。前列腺特異性抗原啟動子(pｒｏstatespecｉfｉcantiｇenｐrｏmoｔeｒ,ＰSＰA)含有高度的組織特異性,僅在PＳPA陽性的前列腺癌細(xì)胞中體現(xiàn)。Yu等構(gòu)建了以人免疫缺點(diǎn)病毒為基礎(chǔ)的病毒體現(xiàn)載體,在該載體中使ＰSＰＡ和DTＡ(白喉毒素A基因)基因形成融合基因。成果表明,PSPA能夠高效、特異地在前列腺癌細(xì)胞中啟動DTＡ基因體現(xiàn)并產(chǎn)生自殺作用。體外實驗表明，它在雄激素存在的狀況下能夠殺死PSA陽性的前列腺癌細(xì)胞。在異種移植PSA陽性的前列腺癌細(xì)胞鼠體內(nèi)實驗證明,能夠使腫瘤細(xì)胞快速退化,并使其存活時間超出一年而沒有腫瘤的進(jìn)展,但在ＰSＡ陰性的對照卻沒有這種效果。這一研究成果表明轉(zhuǎn)染基因能夠?qū)M(jìn)展的前列腺腫瘤產(chǎn)生治療效果。假單胞菌外毒素A(pseudomonasｅxotoｘｉnA,PＥ)為不可逆性蛋白合成克制劑,將其細(xì)胞結(jié)合域刪除即為PE40,其僅體現(xiàn)出極低的細(xì)胞和動物毒性。將編碼TGFα的基因與PＥ4０基因融合，其體現(xiàn)產(chǎn)物現(xiàn)有TGFα受體結(jié)合活性又保存有PE的細(xì)胞毒性。某些腫瘤如人類胰腺癌組織過分體現(xiàn)上皮生長因子受體（EGFreceptor),其配體之一即TGFα。實驗證明TP４０這一雙功效蛋白能克制或殺傷體現(xiàn)高水平EGF受體的腫瘤細(xì)胞。2.6細(xì)胞因子與血清白蛋白融合血清白蛋白是血漿的重要成分,正常狀況下不易透過腎小球,體內(nèi)分布極廣并且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是抱負(fù)的藥品載體。白蛋白融合技術(shù)含有下列優(yōu)點(diǎn)：白蛋白與目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接,不需額外的體外解決；白蛋白的體現(xiàn)水平較高，與其融合后能夠提高目的蛋白的體現(xiàn)水平;白蛋白是一種穩(wěn)定的“惰性”蛋白,與其融合后能夠提高目的蛋白的穩(wěn)定性;白蛋白融合蛋白含有較長的藥品半衰期。如人血清白蛋白(HAS)本身在血漿中的半衰期長達(dá)19d,將小分子蛋白藥品與HSA融合可有望提高在血液中的半衰期?，F(xiàn)在，多個蛋白與HSＡ融合后在實驗動物體內(nèi)半衰期的延長得到了證明。唱韶紅等用畢赤酵母中體現(xiàn)的HSAhIＦNα2b融合蛋白在獼猴體內(nèi)的半衰期約為普通ＩFNα的２0倍。美國馬里蘭州人類基因組科學(xué)(HGＳ)公司進(jìn)行了一系列HSA融合蛋白質(zhì)藥品的研究，HSＡ/IＦNα融合蛋白[９]、HSA／IFNβ融合蛋白(albuferｏnβ)［10]、ＨSＡ／rIＬ2融合蛋白（ａｌbulｅukin)[1１]、HSA／ｒGCSF融合蛋白(albｕｇrａnｉn）［１2]、HＳA/ｒＨGH融合蛋白(albuｔropin)[１3]都含有明顯的半衰期延長作用。３細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的HYPEＲＬＩNK""發(fā)展前景細(xì)胞因子的種類繁多且每一種細(xì)胞因子的作用又含有多樣性,其在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中的互相作用更為復(fù)雜,因而細(xì)胞因子融合蛋白的研究幾乎涵蓋了全部常見的細(xì)胞因子。在功效上有關(guān)的細(xì)胞因子或分子,其融合蛋白的生物學(xué)活性若能夠高于或等于各個組份簡樸相加的效果,即含有其它單體分子無法比擬的高效性，便有構(gòu)建融合蛋白分子的意義[1４]。另首先,細(xì)胞因子融合蛋白在與特定的靶向性分子結(jié)合之后,可將有一定毒性的細(xì)胞因子選擇性的、特異性的濃集于病灶局部,使全身性的不良反映降至最低點(diǎn),即含有某些單體細(xì)胞因子所不含有的特異性,也是融合蛋白的研究方向之一。另外,諸多融合蛋白雖有衍生因子的雙重活性,但其活性較野生型低或在實際應(yīng)用中與衍生因子配伍不明顯,解決分子的生物學(xué)活性與毒副作用問題是細(xì)胞因子融合蛋白發(fā)展的實踐需求。但是,細(xì)胞因子融合蛋白也有其缺點(diǎn),如在重復(fù)使用時由于已產(chǎn)生了中和抗體而克制了其活性的發(fā)揮。因此，在構(gòu)建細(xì)胞因子融合蛋白時，必須謹(jǐn)慎選擇所融合的細(xì)胞因子,并且在設(shè)計中盡量減少分子量以減少免疫原性。融合蛋白技術(shù)是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ纳锕こ碳夹g(shù)，在腫瘤治療研究中[15]，諸多制品已進(jìn)入了臨床實驗，并獲得了令人鼓舞的進(jìn)展?，F(xiàn)在,有關(guān)動物細(xì)胞因子的研究也得到了迅猛發(fā)展,某些重組細(xì)胞因子已在動物疾病的防止、治療和診療,特別是在發(fā)展安全、高效基因工程疫苗等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。相信在不遠(yuǎn)的將來,人們能夠應(yīng)用細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)設(shè)計和獲得高體現(xiàn)、高活性的融合蛋白制劑,從而為動物疾病的防控帶來新的但愿?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】?

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