藥用植物木霉對(duì)2種病原菌的拮抗作用

藥用植物木霉對(duì)2種病原菌的拮抗作用

四川、云南、貴州等省的特產(chǎn)。在四川,主產(chǎn)在彭州、郫縣、什邡等地,為主要道地藥材之一。根腐病是川芎生產(chǎn)上的重要病害,田間發(fā)病率通常在10%左右,嚴(yán)重者可達(dá)30%以上,給川芎生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。對(duì)川芎根腐病的防治,一般有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治兩種方法。農(nóng)業(yè)防治是通過(guò)深耕翻土,開(kāi)溝排水或進(jìn)行水旱輪作、選擇健壯苓種等措施進(jìn)行的;化學(xué)防治則采用多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行浸種或拌種。這些防治方法不僅復(fù)雜,而且見(jiàn)效慢;化學(xué)農(nóng)藥防治不但污染環(huán)境,防效也較差,不利于無(wú)公害藥業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)和可持續(xù)植物保護(hù)觀念的不斷深入,運(yùn)用生物防治手段控制植物病害已越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視,植物病害的生物防治被認(rèn)為是具有發(fā)展?jié)摿Φ难芯款I(lǐng)域,因此尋求有效的生物防治措施成為川芎生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的需要。本項(xiàng)研究從生長(zhǎng)在不同生態(tài)環(huán)境的中藥材根際土樣中分離篩選出了一批木霉菌株,并進(jìn)行了室內(nèi)拮抗試驗(yàn)和田間防病增產(chǎn)試驗(yàn),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1田間病害調(diào)查2002～2004年期間,每年12月至次年5月的川芎根腐病發(fā)生期,在四川省彭州、郫縣等地,采用隨機(jī)取樣方法調(diào)查川芎根腐病的田塊發(fā)生率,采用5點(diǎn)取樣方法調(diào)查病株率。觀察記載川芎根腐病株的植株及葉片生長(zhǎng)情況,取病株和健株的地下部分,觀察其根部生長(zhǎng)狀況、根內(nèi)外部有無(wú)變色等。1.2四川省根腐病病原體及繁殖特性將田間采集的病株在室內(nèi)進(jìn)行病原菌的分離與純化,通過(guò)病原菌在PSA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀、孢子的形狀和大小等進(jìn)行鑒定。1.3植物根際距表土土壤取樣2002～2004年在四川省彭州、郫縣等中藥材種植地,選擇不同生態(tài)環(huán)境藥用植物根際距表土5～10cm土層土壤取樣,裝袋編號(hào)。木霉的分離采用稀釋平板法。將土樣用清水稀釋制成1×10-3濃度的土壤懸浮液,接種于平板后,置25℃培養(yǎng)3d,按常規(guī)方法分離出木霉,并進(jìn)行純化培養(yǎng),并根據(jù)培養(yǎng)性狀進(jìn)行鑒定。1.4病原菌抑菌活性測(cè)定供試病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和茄腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)。將分離獲得的優(yōu)良菌株哈茨木霉T23和供試病原菌,在PDA平板培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3d,分別用打孔器打取直徑5mm的菌絲塊,將病原菌和木霉菌同時(shí)接入直徑9cm的PDA培養(yǎng)皿內(nèi),兩者相距5.0cm,對(duì)照只移植病原菌不移植木霉,設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于28℃培養(yǎng)箱中,72h后,觀察抑菌效果,測(cè)量病原菌菌落直徑,計(jì)算抑菌率。同時(shí)挑取兩菌落交界處的氣生菌絲,在光學(xué)顯微鏡下觀察。抑菌率(%)=[(無(wú)木霉菌下病原菌菌落直徑-有木霉菌下病原菌菌落直徑)/無(wú)木霉菌下病原菌菌落直徑]×100%。1.5處理方法及處理試驗(yàn)在四川省彭州市敖平鎮(zhèn)進(jìn)行,川芎于2003年8月15日移栽。栽培規(guī)格為:行距0.34m,窩距0.2m,種植密度為150000株/hm2。將哈茨木霉菌株T23、T158分別制備成為生防制劑,試驗(yàn)設(shè)置T23制劑每公頃施用3750g、7500g兩種處理,T158制劑每公頃施用3750g、7500g兩種處理,同時(shí)設(shè)置對(duì)照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑每公頃施用7500g處理,以及不施藥的空白對(duì)照。木霉和多菌靈均在川芎移栽時(shí)按施入移栽窩內(nèi)。各處理隨機(jī)排列,重復(fù)3次,小區(qū)面積為20.0m2。每小區(qū)5點(diǎn)取樣,每點(diǎn)調(diào)查0.67m2的所有植株,在2004年川芎根腐病發(fā)生盛期的5月25日調(diào)查各處理川芎根腐病發(fā)生情況(表1),計(jì)算病株率、病情指數(shù)和防治效果,并在川芎收獲期測(cè)定每小區(qū)川芎鮮重產(chǎn)量。病株率(%)=(病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))×100,病情指數(shù)=[Σ(各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)級(jí)別)/(調(diào)查總株數(shù)×9)]×100,防治效果(%)=[(對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù))/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)]×100。2結(jié)果與分析2.1下莖的生長(zhǎng)與形態(tài)川芎根腐病的危害癥狀:川芎根腐病在川芎生長(zhǎng)的整個(gè)生育期均可發(fā)生,4月中下旬至5月下旬進(jìn)入盛發(fā)期。川芎植株發(fā)病后,地上部從外圍的葉片開(kāi)始褪色發(fā)黃,并逐漸向心葉擴(kuò)展,最終凋萎;地下塊莖(早期為苓種)的病部呈褐色至紅褐色,發(fā)干,部分變?yōu)樗疂n狀,然后內(nèi)部壞死。若遇天氣潮濕多雨,常變?yōu)闈窀?根莖迅速腐爛,甚至無(wú)法從土中拔起。病株的一般生長(zhǎng)明顯遲緩,長(zhǎng)勢(shì)較弱,根較小。到后期,整個(gè)植株完全停止生長(zhǎng),枯死,塊莖腐爛。川芎根腐病的發(fā)生情況:2002～2004年期間在四川省彭州、郫縣等地的川芎田塊調(diào)查表明,在43塊調(diào)查田塊中,有31塊田發(fā)生川芎根腐病,有病田塊率達(dá)72.09%,川芎根腐病在田間的發(fā)病株率一般為8.25%～19.23%,平均為15.22%,重病田達(dá)54.17%,嚴(yán)重影響到川芎的產(chǎn)量和品質(zhì)。2.2茄腐皮鐮皮認(rèn)識(shí)生長(zhǎng)方向經(jīng)分離鑒定,川芎根腐病是由尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum和茄腐皮鐮刀菌Fusariumsolani兩種病原菌復(fù)合浸染引起的。尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum在PSA上,氣生菌絲體呈絮狀,生長(zhǎng)茂盛,菌落反面呈淡紫色至紫色。小孢子生于單茁瓶梗上,或有短的分生孢子梗,數(shù)量多,l～2個(gè)細(xì)胞,多呈橢圓形,大小:4.8～9.0μm×1.4～2.6μm,大孢子紡錘形至鐮刀形,孢壁薄,兩端尖,頂細(xì)胞稍呈鉤狀,有足細(xì)胞,大多3隔膜,極少4～5隔膜。茄腐皮鐮刀菌Fusariumsolani在PSA上,菌絲體呈白色至淡紫色,生長(zhǎng)較茂盛,絮狀,菌落反面呈紫色。小分生孢子很多,生于單茁的瓶梗上,無(wú)色單胞,卵圓形至紡錘形,大小:6～15μm×2～4μm;大分生孢子生于具分枝的分生孢子梗上,產(chǎn)孢細(xì)胞瓶梗型,大分生孢子紡錘形,無(wú)色,稍彎,頂細(xì)胞稍尖,足細(xì)胞較鈍,3～5隔膜,一般3分隔,少見(jiàn)5分隔。厚壁孢子較多,單生或多為2個(gè)串生,球形,淡黃色。2.3不同品種的樹(shù)莓木霉菌的獲得木霉廣泛存在于藥用植物根際土壤中,用稀釋平板法共從32份土樣中分離到24個(gè)木霉菌株。經(jīng)鑒定表明,哈茨木霉(Trichoderma.harzianum)、桔綠木霉(T.citrinoriride)為主要種群。在獲得的24個(gè)木霉菌株中,哈茨木霉13個(gè),占54.17%;桔綠木霉6個(gè),占25.00%;擬康氏木霉4個(gè),占16.67%;其它木霉1個(gè),占4.17%。通過(guò)室內(nèi)初步篩選,獲得對(duì)鐮刀菌拮抗作用較強(qiáng)的菌株有哈茨木霉T23、T158和桔綠木霉T56等。2.4兩種刀菌的生長(zhǎng)抑制率不同菌株對(duì)尖孢鐮刀菌和茄腐皮鐮刀菌的拮抗效果差異較大,其中以哈茨木霉T23、T158的拮抗效果最強(qiáng)(表2)。對(duì)峙培養(yǎng)到第3d時(shí),T23、T158菌株對(duì)尖孢鐮刀菌生長(zhǎng)抑制率分別為84.07%和83.47%;對(duì)茄腐皮鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制率分別為78.83%和82.07%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移,病原菌菌絲生長(zhǎng)受到明顯抑制或停止,到第6d后全部被木霉菌絲所覆蓋。取木霉與兩種鐮刀菌兩菌落交界處的氣生菌絲,在光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn),兩種鐮刀菌菌絲被木霉菌絲纏繞、寄生,病菌菌絲細(xì)胞變短,且病菌的孢子含量很少,而木霉的孢子量很大。說(shuō)明木霉對(duì)兩種鐮刀菌的拮抗作用方式,在于營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)、寄生兩種形式。2.5對(duì)越界治病效果木霉對(duì)川芎根腐病具有較好的防治效果,哈茨木霉T23制劑、T158制劑的幾種劑量處理均顯著降低川芎根腐病的發(fā)生(表3)。其中,哈茨木霉T23制劑3750g/hm2、7500g/hm2對(duì)川芎根腐病的防治效果分別達(dá)56.89%、63.90%,哈茨木霉T158制劑3750g/hm2、7500g/hm2對(duì)川芎根腐病的防治效果分別為57.17%、59.73%,這4種處理均較化學(xué)農(nóng)藥多菌靈7500g/hm2的防治效果好。同時(shí),木霉制劑處理還能顯著提高川芎產(chǎn)量,哈茨木霉T23制劑兩種劑量處理的產(chǎn)量達(dá)11925.0～12462.0kg/hm2,較空白對(duì)照增產(chǎn)12.49%～17.56%;T158制劑的兩種劑量處理的產(chǎn)量達(dá)11050.5～11199.0kg/hm2,較空白對(duì)照增產(chǎn)4.25%～5.65%。3病料的微生物防治川芎根腐病是由尖孢鐮刀菌和茄腐皮鐮刀菌復(fù)合浸染引起的一種土傳病害,發(fā)病一般從塊莖開(kāi)始,隨后擴(kuò)展到地上部,使葉片出現(xiàn)褪色發(fā)黃病斑。地下塊莖的病部呈褐色至紅褐色水漬狀,嚴(yán)重者塊莖腐爛。由于塊莖表皮呈害色,表面多須根,難于觀察塊莖的病部癥狀,所以本試驗(yàn)在調(diào)查病害時(shí),依據(jù)的是地上部葉片發(fā)病癥狀。川芎根腐病的病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道,本文根據(jù)結(jié)合多年研究實(shí)踐,采用0,1,3,5,7,9共6級(jí)的分級(jí)方法,能夠較為準(zhǔn)確地區(qū)分病株的發(fā)病級(jí)別,以及確定各處理的發(fā)病病情指數(shù),具有一定的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。更為科學(xué)、準(zhǔn)確的川芎根腐病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),還有待于進(jìn)一步研究制定。目前已發(fā)現(xiàn)很多微生物對(duì)植物病原菌具有抑制作用,木霉菌就是一類普遍存在并有重要經(jīng)濟(jì)作用的拮抗生物。有報(bào)道表明,木霉屬中的某些菌株對(duì)立枯絲核菌、鐮刀菌等具有較強(qiáng)的抗生活性,因而可用作生物防治的有益微生物。本研究將木霉作為生防益菌,以引起川芎根腐病的鐮刀菌為防治對(duì)象,采用室內(nèi)拮抗試驗(yàn)與田間試驗(yàn)相結(jié)合,篩選出的木霉菌株哈茨木霉T23、T158對(duì)川芎根腐病有顯著的控制作用,培養(yǎng)制成的哈茨木霉T23制劑、T158制劑均能顯著控制川芎根腐病的發(fā)生,制劑7500g/hm2對(duì)川芎根腐病的防治效果分別為63.90%和57.17%,優(yōu)于目前常用化學(xué)農(nóng)藥多菌靈,顯示了哈茨木霉T23、T158菌株在防治川芎根腐病方面的應(yīng)用潛力。有研究表明,木霉菌對(duì)植物病原菌的作用有多種方式,主要包括競(jìng)爭(zhēng)、寄生、抗生和溶菌等作用。本文研究的哈茨木霉T23、T158等菌株,能纏繞、寄生尖孢鐮刀菌、茄腐皮鐮刀菌的菌絲,使病