應用rna干擾技術抑制結腸癌血管內皮生長因子表達

應用rna干擾技術抑制結腸癌血管內皮生長因子表達

血管再生對于腫瘤的生長非常重要。許多生長因子參與了血管再生，尤其是血管再生a。VEGF是一個45kDa的肝素結合生長因子,可以被低氧誘導因子1a所誘導而合成增加,它通過與其酪氨酸激酶受體,特別是VEGFR-2結合,參與血管再生的許多關鍵步驟,包括內皮細胞增生、侵蝕、遷移和存活,以及血管的通透性。VEGF可以被大多數(shù)腫瘤分泌,包括肺、胃腸道、腎、胸腺、膀胱、卵巢和宮頸,VEGF在體內的表達水平與腫瘤的進展和侵蝕相關。RNA干擾技術仍然是目前研究的熱點,由于它們具有較強的序列特異性,并能有效的抑制靶基因的表達,故已被廣泛應用于各種疾病的治療和功能基因組學的研究中。已有研究應用siRNA抑制VEGF的表達,來治療結腸癌、前列腺癌和肝癌,并取得了明顯的效果。由于并不是所有與靶基因互補的序列都能產生強的RNA干擾作用,故在其走向臨床應用前,必需有大量的實驗來篩選,以獲得更有效的序列,因此,我們設計了本實驗,擬通過RNA干擾抑制結腸癌HT29細胞VEGF基因的表達,為下一步探討VEGF基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用,以及抗腫瘤RNA干擾藥物開發(fā)的研究奠定基礎。1材料和方法1.1免疫熒光檢測試劑質粒pTZU6+1,內含人U6啟動子Ⅲ,由美國UniversityofMichiganDr.DavidEngelke饋贈;結腸癌細胞HT29均由本實驗室提供;細胞培養(yǎng)用血清為國產四季青新生牛血清,1640培養(yǎng)基為本室提供;寡核苷酸DNA片段及引物合成由上海英俊公司完成,測序由上海英俊公司完成。T4DNA連接酶、內切酶和Marker為TaKaRa公司產品;質粒提取采用Qiagen公司的去內毒素大量提取試劑盒,轉染試劑為美國Invitrogen公司的脂質體LipofectaminTM2000,其稀釋液為Opti-MEM。RT-PCR檢測用Qiagen公司的一步法試劑盒,細胞總RNA提取用Qiagen公司的RNeasyMinikit試劑盒。免疫熒光檢測試劑盒SABC-Cy3購于武漢博士德公司,第一抗體小鼠抗人VEGF多抗購于北京中山公司,Cy3熒光標記的兔抗小鼠二抗購于武漢博士德公司。Westernblotting所需一抗,小鼠抗人VEGF多抗和小鼠抗人Actin,二抗,辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠IgG,均購于北京中山公司,辣根過氧化物酶的底物為美國Pierece公司SuperSignal化學發(fā)光底物,硝酸纖維膜(NC膜)購于德國Roche公司。Northern雜交用α-32P-dATP購于北京福瑞生物技術工程公司,DNA探針標記采用美國Amersham公司隨機引物標記試劑盒MegaprimeDNAlabelingsystems進行,尼龍膜為德國Roche公司的HybondTMN+尼龍膜。凝膠成像和圖像分析采用英國劍橋Synoptics有限公司生物影像系統(tǒng)中的geneGenius和GeneTools軟件(版本3.05)進行。采用日本OlympusCK-40倒置熒光顯微鏡和美國MediaCybemeticsImage-ProPlusv5.1進行熒光檢測和圖像分析。1.2方法1.2.1vegf基因缺失菌株的構建抗VEGF的RNA干擾靶區(qū)選擇參照E-RNAi網上提供的服務完成(http://e-rnai.dkfz.de/),先將VEGF的mRNA序列提交,得到全部的有效序列,選出兩個得分較高且不含連續(xù)三個以上A的序列作為最終的VEGF靶序列,它們分別是:V1:TGAAGTTCATGGATGTCTATC和V2:ACATCACCATGCAGATTATGC,分別位于VEGF基因的122～142和302～322位。將其設計成能在體內轉錄成反向互補且以TTCG為環(huán)的小發(fā)夾樣RNA。先人工合成寡核苷酸DNA片段,在含200mmol/LNaCl的退火緩沖液中進行退火,連接到pTZU6+1載體上,構建成抗VEGF基因的pShRNA-V1和pShRNA-V2,經酶切鑒定后,再測序證實。以抗綠熒光蛋白(GFP)的shRNA表達載體(pShRNA-GFP)作為無關干擾對照,GFP的靶區(qū)為GCTGACCCTGAAGTTCATC。1.2.2psql-4細胞的轉染用脂質體將pShRNA-V1和pShRNA-V2分別轉染HT29細胞,以未轉染細胞或以不表達shRNA的空載體pTZU6+1的轉染作為未干擾陰性對照,以pShRNA-GFP的轉染作為無關干擾對照,轉染方式按LipofectaminTM2000說明書進行,即當細胞90%以上融合時進行轉染,先用稀釋液Opti-MEM將質粒和脂質體稀釋,再將二者混合,室溫孵育20min后,直接加于含血清但不含抗生素的細胞培養(yǎng)基中即可。轉染劑量參照我們以前優(yōu)化的結果進行,即對100ml培養(yǎng)瓶中的細胞進行轉染時,pShRNA表達載體或空載體pTZU6用5μg,脂質體LipofectaminTM2000用8μl。轉染后48～72h后,收集細胞進行下游檢測。1.2.3psbs--rna酶法胰酶消化收集細胞,細胞沉淀用10mlPBS漂洗一次,以后的操作按試劑盒說明進行,產物用50μl無RNA酶的水溶解,-80℃中保存,避免反復凍融。1.2.4vegf基因片段的擴增采用Prime3軟件進行引物設計,其引物如下:VEGF的引物為,上游:5′-ctacctccaccatgccaagt-3′,下游:5′-aaatgctttctccgctctga-3′,擴增產物長度為411bp,退火溫度為55℃,用一步法RT-PCR將其擴增出,電泳觀察產物的大小與預期相符后,將產物裝入pGEM-T載體上,再測序證實擴增產物為所需的VEGF基因片段。半定量檢測時,以hGAPDH擴增產物為內參,hGAPDH的上游引物為5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′,下游引物為5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′,擴增產物為240bp(678bp～918bp)。在一個總體積為25μl的反應體系中,同時加入VEGF和GAPDH兩對引物,總RNA模板加1μl,逆轉錄條件為50℃,30min,PCR的退火溫度為55℃,循環(huán)數(shù)為24,取5μl產物進行電泳,成像后用GeneTools軟件進行定量分析。1.2.5vegf片段的標記25μg細胞總RNA上樣電泳于1.2%的甲醛變性凝膠中,再過夜轉移至尼龍膜上,80℃干烤2h固定后,42℃雜交過夜,探針為α-32P-dATP標記的VEGF片段,標記方法按試劑盒操作說明進行。尼龍膜經漂洗后,-80℃曝光48～72h。以凝膠電泳中總RNA的量作為內參,來恒定細胞總數(shù)。1.2.6封閉正常羊肉干轉染48h后,將24孔板細胞用PBS洗滌一次,加4%多聚甲醛固定,再用PBS漂洗;加3%H2O2封閉內源性過氧化物酶,用PBS漂洗后,再用正常山羊血清封閉,室溫1h。加入北京中杉公司鼠小鼠抗人VEGF多抗(1∶500稀釋)37℃孵育2h,經PBS漂洗后,加入Cy3-標記的兔抗小鼠二抗,37℃孵育1h,PBS漂洗后,二甲苯透明,中性樹膠封片,熒光顯微鏡下(波長568～574nm)觀察陽性細胞并照相,陽性細胞呈鮮紅色,用Image-ProPlus軟件計算熒光亮度和細胞總數(shù),以總熒光亮度與細胞總數(shù)的比值來反映VEGF表達水平。1.2.7vegf-計劃免疫法檢測免疫組化收集轉染后72h的HT29細胞,用10mlPBS洗兩遍,細胞沉淀用60μl蛋白上樣緩沖液重懸混勻,煮沸5min,離心12000r/min,10min,取上清20μl加樣于10%SDS凝膠,90V恒壓,電泳2h,通過電轉方式,將凝膠中蛋白質轉移至NC膜上,將NC膜用封閉液封閉1h,于抗VEGF多克隆抗體中40℃過夜孵育,用200mlPBS漂洗3次,室溫下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化學發(fā)光底物,2min后,于發(fā)光檢測儀中檢測并成像。NC膜再用200mlPBS漂洗3次,于抗Actin抗體中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,室溫下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化學發(fā)光底物,5min后,再于發(fā)光檢測儀中檢測并成像。2結果2.1重組質粒和空載體的鑒定重組質粒由于插入序列使原SalI酶切位點消失,故不能被SalI切開;重組質粒和空載體經HindIII和EcoRI雙酶切,分別產生2800bp+395bp及2800bp+352bp的片段,可以通過電泳看出二者之間的差別,以此進行重組鑒定,最后測序證實序列正確。2.2egf基因片段先通過電泳觀察擴增產物電泳的位置與預期411bp相符,再將其裝入T載體上,測序證實為所需的VEGF基因片段。利用RT-PCR檢測VEGF基因表達受抑情況,如圖1,2所示,在HT29細胞中,與轉染pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2均可以明顯抑制VEGF基因的表達,GeneTools軟件定量分析顯示,pShRNA-V1和V2的抑制率分別為42%和40%。2.3vegfmna的抑制率在HT29細胞中,如圖3,4所示,以凝膠電泳中總RNA為內參,GFP為無關序列干擾組,V1和V2組VEGFmRNA的抑制率分別為87%和89%。2.4胞漿內延遲表達如圖5,6所示,免疫熒光檢測顯示,在HT29細胞中,VEGF表達主要以胞漿內彌漫分布為主,色澤鮮紅;與無關干擾序列pTZU6-GFP和陰性對照pTZU6+1相比,pTZU6-V1和V2能明顯抑制VEGF蛋白的表達,其抑制率分別為67%和73%。2.5psqla-pv、vdvp對vegf蛋白表達的影響如圖7,8所示,Westernblotting顯示,在HT29細胞中,與陰性對照pTZU6+1和無關干擾序列pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2能明顯抑制VEGF蛋白的表達,其抑制率分別為69%和82%。3rna干擾對vegf基因表達的影響血管再生是在預存血管床的基礎上產生新生毛細胞血管的過程,這一過程需要多種細胞因子參與。這一過程的不可控制,是導致腫瘤發(fā)生的重要病理基礎。雖然一些蛋白,如肝細胞生長因子、腫瘤壞死因子和成纖維生長因子已被證實是血管再生的刺激物,但最重要血管再生生長因子是VEGF,它在人類的許多腫瘤中是過量表達的。誘導VEGF表達的機制有許多,其中缺氧長期以來一直被認為是VEGF潛在的誘導劑。研究發(fā)現(xiàn),無論術前有無轉移,手術后血清VEGF水平明顯降低,這從一個側面說明腫瘤細胞產生的VEGF可能是大腸癌血清VEGF的主要來源。研究表明,VEGF具有促進血管內皮細胞增殖;增加血管通透性;促進血管支持物的生成;抑制腫瘤細胞的凋亡的功能。由于VEGF的功能強大,故已成為腫瘤基因治療的靶點。另外,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)VEGF的高表達還與類風濕性關節(jié)炎和眼底血管病變相關,故已有研究通過抑制VEGF表達來治療這些疾病,并取得了顯著的效果。RNA干擾作為一種新型的生物技術已廣泛應用于多領域和多學科的研究中,并取得了顯著的效果。已有研究通過RNA干擾技術,抑制結腸癌、前列腺癌和視網膜上皮細胞的VEGF基因的表達,并發(fā)現(xiàn)VEGF的抑制可以使腫瘤細胞的增殖能力減弱,腫瘤內新生血管減少,故認為針對VEGF基因進行的RNA干擾,是一種有效的抗腫瘤方式。我們在本實驗中,也發(fā)現(xiàn)針對結腸癌HT29細胞VEGF的兩種RNA干擾序列能有效抑制VEGFmRNA和蛋白的