燒傷對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖能力及il

燒傷對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖能力及il

大面積燒傷后，身體神經(jīng)系統(tǒng)包括各種免疫活動(dòng)細(xì)胞和體液免疫，變化程度不同，對(duì)異?；虍惓５拿庖叻磻?yīng)產(chǎn)生了一定的抑制反應(yīng)。具體表現(xiàn)為特異性細(xì)胞免疫功能受抑和非特異性炎癥反應(yīng)亢進(jìn)兩方面,而細(xì)胞免疫受抑又以T細(xì)胞功能受抑尤為突出,它是嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫功能下降和并發(fā)感染及其他并發(fā)癥的重要原因。雖然過去對(duì)燒傷后機(jī)體T細(xì)胞功能改變報(bào)道較多,但從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)分析T細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制尚鮮有報(bào)道?；A(chǔ)研究表明經(jīng)TCRα/β和CD28通路活化是T淋巴細(xì)胞活化增殖并執(zhí)行功能的主要信號(hào)通路。本研究以18%Ⅲ度燙傷小鼠為模型,以T淋巴細(xì)胞TCRα/β和CD28通路為研究對(duì)象,對(duì)T細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。1材料和方法1.1小鼠正壓熱蒸汽損傷模型昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重23～26g,隨機(jī)分為正常對(duì)照、傷后2、12、24、96、168h共6組,每組10只。制備燒傷模型:將小鼠背部剪毛,清醒狀態(tài)下高壓熱蒸汽造成18%TBSAⅢ度燙傷(病理切片證實(shí))。傷后腹腔注射等滲鹽水3ml預(yù)防休克,各組動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)相腋動(dòng)脈放血活殺,無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液。1.2t細(xì)胞的分離參照文獻(xiàn)方法,以尼龍纖維分離細(xì)胞懸液中的T細(xì)胞,酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色,96%以上為T細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色證明分離出T細(xì)胞存活率>95%。1.3指標(biāo)的識(shí)別和方法1.3.1小鼠檢測(cè)cd2取調(diào)整濃度至1×106/ml分離純化的T細(xì)胞懸液1ml,以1400r/min(普通臺(tái)式離心機(jī))離心5min,去上清,以冷磷酸鹽緩沖液(pH7.2)200μl洗滌,去上清,加入Anti-mouseTCRα/βFITC(美國(guó)Sigma公司)4μl,陰性對(duì)照加入小鼠IgG,置4℃避光孵育30min,離心,棄上清,反復(fù)洗滌2次,以相同緩沖液1ml重懸后檢測(cè)。間接法測(cè)定CD28:一抗為Purifiedanti-mouseCD28(HamsterIgG),二抗為Anti-hamsterIgG-FITC。以加入熒光抗體測(cè)得的陽性率減陰性對(duì)照陽性率為測(cè)定結(jié)果。1.3.2膜ptk提取物制備取1ml分離純化調(diào)濃度至3×106/ml的T細(xì)胞的懸液ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清后壓積細(xì)胞立即于4ml胞漿PTK提取液(1mmol/LMgCl2、1mmol/LEDTA、10mmol/LDTT、1mmol/LPMSF、50×10-3g/LAprotinin、10%(體積比)Glycerol、10mmol/LTris-HClpH7.4)混懸。冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3)4℃,7000×g離心去除細(xì)胞核及完整細(xì)胞。上清37000×g,4℃離心1h,棄上清,沉淀復(fù)懸于4ml膜PTK提取液(20mmol/LMg(AC)2、5mmol/LNaF、0.2mmol/LEDTA、1.0mmol/LDTT、0.5%(體積比)NP-40)中,冰上提取1h。再次冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3),4℃、37000×g離心1h,所得上清即為膜PTK提取物(-20℃凍存?zhèn)錅y(cè)蛋白含量及酶活性);活性測(cè)定參照Kong方法進(jìn)行。1.3.3含胞漿pkc酶活性測(cè)定同樣取新鮮分離純化調(diào)濃度至3×106/ml的T細(xì)胞懸液1ml,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清,加入4℃預(yù)冷緩沖液(50mmol/Lβ-2ME,1mmol/LPMSF、1mmol/LEGTA、2.5mmol/LMgCl2、0.34mol/L蔗糖、10mmol/LTris-HClpH7.5)4ml,超聲破碎(300mA,20s×3),37000×g,4℃離心60min,收集上清,上清即含胞漿PKC酶。(-20℃凍存?zhèn)錅y(cè)蛋白含量及酶活性);活性測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.3.4濃度試驗(yàn)2以ConA(5×10-3g/L)為刺激原,Fura-2/AM熒光探針法測(cè)定。1.3.5il-2-實(shí)驗(yàn)取5×106/ml純化T細(xì)胞懸液0.5ml,加入10g/LConA0.5ml混勻,5%(體積比)CO2、37℃孵箱培養(yǎng)24h,離心收集上清,ELISA法測(cè)定IL-2含量(試劑購自深圳晶美公司)。T淋巴細(xì)胞增殖活性測(cè)定按MTT法進(jìn)行。1.4統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果均以ˉx±s表示,采用STAT5.0統(tǒng)計(jì)程序處理,包括行方差分析、方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)、相關(guān)分析。2結(jié)果2.1傷后24h評(píng)分與正常對(duì)照組相比,燒傷后脾臟T淋巴細(xì)胞膜TCRα/β呈不同程度降低,以傷后24～96h最明顯;燒傷后T淋巴細(xì)胞膜表面共刺激分子CD28陽性表達(dá)亦降低,且降低時(shí)相明顯早于TCRα/β,即傷后12h已明顯降低,并持續(xù)到傷后96h,見表1。2.24h抑制與正常對(duì)照組相比,參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PTK活性于傷后2h即出現(xiàn)明顯受抑,傷后12、、24h抑制非常顯著,傷后168h出現(xiàn)回升;胞漿游離鈣Ca2+濃度傷后各時(shí)相均降低,其變化趨勢(shì)與PTK活性改變較一致,胞漿PKC活性出現(xiàn)先升高(12h,P<0.01),后降低(96～168h,P<0.01)的雙相改變,見表2。2.3il-2變化與正常對(duì)照組相比,燒傷小鼠脾臟T細(xì)胞增殖能力減弱,明顯減弱出現(xiàn)于傷后12h,傷后24、96h顯著減弱。IL-2分泌傷后明顯降低,傷后24～168h降低有非常顯著性意義(P<0.01)。二者變化趨勢(shì)與TCRα/β及CD28陽性率改變較一致。相關(guān)性分析表明:參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的PTK活性、IL-2分泌及T淋巴細(xì)胞增殖能力呈非常顯著正相關(guān)(rPTK/IL-2=0.569,rPTK/IL-2=0.733),見表3。3胞漿優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體特異性細(xì)胞免疫功能降低是誘發(fā)感染和其它并發(fā)癥的重要原因。改善傷后機(jī)體免疫功能是防治感染和多臟器功能衰竭及提高大面積深度燒傷治愈率的關(guān)鍵。從根本上糾正傷后受損的細(xì)胞免疫功能,必須首先弄清導(dǎo)致燒傷后特異性細(xì)胞免疫功能下降的分子機(jī)制?；A(chǔ)研究表明,TCRα/β和CD28通路是T細(xì)胞活化的主要信號(hào)通路。TCRα/β和CD28接收胞外信號(hào)后,經(jīng)具有PTK活性的CD3ζ鏈跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞以后,即由肌醇磷脂特異性磷脂酶C水解肌醇磷脂產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DG),升高胞漿游離鈣[Ca2+]濃度和活化PKC,進(jìn)而激活核因子NF-κB、AP-1、NFAT等,調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而影響細(xì)胞功能。雖然已有報(bào)道,嚴(yán)重?zé)齻骉H1/TH2平衡破壞,T細(xì)胞反應(yīng)偏向TH2型反應(yīng),引起TH1型細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ)產(chǎn)生減少,而TH2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-10)等分泌增加,但這種傾斜是傷后T細(xì)胞總體活性受抑條件下的相對(duì)偏移。本實(shí)驗(yàn)以TCRα/β、CD28信號(hào)途徑為研究對(duì)象,探索嚴(yán)重?zé)齻骉細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制。綜合分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明:嚴(yán)重?zé)齻?參與T細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCRα/β和CD28、PTK活性受抑是制約嚴(yán)重?zé)齻骉淋巴細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因素。而從TCRα/β、CD28、PTK三者關(guān)系比較分析中可以發(fā)現(xiàn),傷后PTK活性受抑又處于核心地位,其發(fā)生時(shí)相甚至早于TCRα/β和CD28。胞漿游離鈣濃度是淋巴細(xì)胞活化的最靈敏指標(biāo),是各種胞外刺激引起細(xì)胞激活的早期變化之一。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[Ca2+]于傷后12h即出現(xiàn)明顯降低,并持續(xù)整個(gè)時(shí)相。雖然決定胞漿[Ca2+]濃度有胞外進(jìn)入量和胞內(nèi)鈣儲(chǔ)釋放兩種因素,但由于PI-PLC活性傷后12h即已降低,故推測(cè),嚴(yán)重?zé)齻蟀麧{游離[Ca2+]水平降低主要由于PI-PLC下游產(chǎn)物三磷酸肌醇(IP3)動(dòng)員胞內(nèi)鈣儲(chǔ)釋放減少所致。國(guó)內(nèi)外亦有研究報(bào)道,胞內(nèi)游離[Ca2+]濃度降低是傷后T細(xì)胞增殖能力減弱和IL-2分泌降低的重要原