燒傷后淋巴細(xì)胞肌醇脂質(zhì)信號(hào)系統(tǒng)活性的變化

燒傷后淋巴細(xì)胞肌醇脂質(zhì)信號(hào)系統(tǒng)活性的變化

（3）自然資源項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)39500149）。②重慶第三軍醫(yī)大學(xué)臨床檢驗(yàn)教研室,重慶400038大面積深度燒傷后,患者死亡率仍然很高。隨著對(duì)傷后機(jī)體生理改變和液體復(fù)蘇等方面認(rèn)識(shí)的加深,感染已成為人們關(guān)心的最主要問題。雖然引起感染的最直接原因主要是皮膚屏障功能的損傷和腸源性感染,但燒傷后機(jī)體免疫功能受損應(yīng)該是引起感染的重要內(nèi)在因素。我們清楚,T淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要載體和執(zhí)行細(xì)胞。大面積深度燒傷后,機(jī)體免疫系統(tǒng)包括多種免疫活性細(xì)胞和體液免疫均發(fā)生了不同程度的改變,具體表現(xiàn)為特異性細(xì)胞免疫功能受抑和非特異性炎癥反應(yīng)亢進(jìn)兩方面,而細(xì)胞免疫受抑又以T細(xì)胞功能受抑尤為突出,故可以肯定細(xì)胞免疫功能受損應(yīng)該是嚴(yán)重?zé)齻蟛l(fā)感染及其他并發(fā)癥的重要原因。早期研究表明,燒傷后機(jī)體受損的T細(xì)胞功能以IL-2、IFN-γ分泌降低和IL-4、IL-10分泌增加為主要特征。最近,燒傷后TH1/TH2平衡的破壞被認(rèn)為是傷后機(jī)體免疫紊亂的主要機(jī)制,但導(dǎo)致TH1/TH2平衡漂移的原因尚未得到闡明。近十年來,基礎(chǔ)研究對(duì)T淋巴細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)闡明,即肌醇脂質(zhì)信號(hào)系統(tǒng)是T淋巴細(xì)胞活化和執(zhí)行功能的最主要信號(hào)途徑。雖然過去對(duì)燒傷后機(jī)體T細(xì)胞功能改變報(bào)道較多,但從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入手系統(tǒng)地分析T細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制尚鮮有報(bào)道,本文以18%Ⅲ度燙傷小鼠為模型,對(duì)T細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制進(jìn)行探討。1材料和方法1.1小鼠uf-t-uf4/hsb型熱蒸汽損傷tba度昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重23～26g,隨機(jī)分為正常對(duì)照、傷后2、12、24、96、168h共6組,每組10只。將小鼠背部剪毛,清醒狀態(tài)下高壓熱蒸汽造成18%TBSAⅢ度燙傷(病理切片證實(shí))。傷后腹腔注射等滲鹽水3ml預(yù)防休克,各組動(dòng)物于相應(yīng)時(shí)相腋動(dòng)脈放血活殺,無菌制備脾淋巴細(xì)胞懸液。1.2t細(xì)胞的分離參照文獻(xiàn)方法,以尼龍毛纖維分離細(xì)胞懸液中的T細(xì)胞,酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色,96%以上為T細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色證明分離出T細(xì)胞存活率>95%。1.3指標(biāo)的識(shí)別和方法1.3.1胞漿ptk提取物的制備取1ml分離純化調(diào)濃度至3×106ml-1的T細(xì)胞懸液,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清后立即懸于4ml漿PTK提取液(10mmol/LTris-HClpH7.4,1mmol/LMgCl2、1mmol/LEDTA、10mmol/LDTT、1mmol/LPMSF、50×10-3g/LAprotinin、體積分?jǐn)?shù)為10%Glycerol),冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3)4℃,7000g離心,除去細(xì)胞核及完整細(xì)胞。上清37000g,4℃離心1h,所得上清即為胞漿PTK提取物(-20℃凍存?zhèn)錅y(cè)蛋白含量及酶活性);沉淀復(fù)懸于膜溶解液中[20mmol/LMg(AC)2,5mmol/LNaF,0.2mmol/LEDTA,0.8mmol/EGTA,1mmol/LDTT,質(zhì)量濃度為0.5%NP-40,50mmol/LTris-HClpH7.5],置冰上提取1h,期間于冰溶中250mA超聲3次,每次10s,再次4℃,37000g離心1h,獲得上清即為膜性PTK提取物?；钚詼y(cè)定參照KongSK方法進(jìn)行,考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白含量。1.3.2可溶性酶檢測(cè)方法同樣取新鮮分離純化調(diào)濃度至3×106ml-1T細(xì)胞懸液1ml,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清,加入4℃預(yù)冷緩沖液A(50mmol/Lβ-2Me,1mmol/LPMSF、1mmol/LEGTA、2.5mmol/LMgCl2、0.34mol/L蔗糖、10mmol/LTris-HClpH7.5)4ml,超聲破碎(300mA,20s×3),37000g,4℃離心60min,收集上清,上清即含胞漿可溶性酶。離心沉淀部分加入含0.1%TritonX-100(體積分?jǐn)?shù))勻漿緩沖液(其它成分同緩沖液A),4℃冰箱靜置1h,37000g,4℃離心60min,收集上清,上清液即含轉(zhuǎn)膜部分可溶性酶,活性測(cè)定參照文獻(xiàn)進(jìn)行。1.3.3pi-蒙古國的分離和活性測(cè)試PI-PLC分離及活性測(cè)定均參照張澤林等方法進(jìn)行。1.3.4游離ca++濃度[ca++]io和傳感器合成產(chǎn)物分別測(cè)定傷后脾臟T淋巴細(xì)胞未接受刺激的胞漿游離Ca++濃度[Ca++]io和ConA刺激后Ca++濃度[Ca++]ia,測(cè)定方法為Fura-2/AM熒光探針法。1.3.5il-2,il-10含量各取5×106ml-1純化T細(xì)胞懸液0.5ml,加入10×103g/LConA0.5ml混勻,在體積濃度為5%的CO2、37℃孵箱培養(yǎng)24h,離心收集上清,ELISA法測(cè)定IL-2、IL-10含量(試劑購自深圳晶美公司)。1.3.6新鮮配制的mtt按MTT比色法稍加改進(jìn)進(jìn)行檢測(cè)。即在培養(yǎng)的最后4h每孔加入新鮮配制的濃度為5g/L的MTT10μl。移出上清,加入100μl乙醇放置30min顯色,酶標(biāo)儀上570nm測(cè)定。1.4處理數(shù)據(jù)結(jié)果均以ˉx±s表示,采用STAT5.0統(tǒng)計(jì)程序處理,包括行方差分析、方差齊性檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)相關(guān)分析。2t細(xì)胞肌醇磷脂途徑胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性/濃度變化2.1燒傷后脾臟T淋巴細(xì)胞肌醇磷脂途徑跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶PTK、G-Protein及轉(zhuǎn)膜PKC活性變化與正常對(duì)照相比,燒傷后T細(xì)胞G-protein,PTK活性均于傷后2h即出現(xiàn)明顯降低,傷后12、24h降低非常顯著,傷后168h出現(xiàn)回升,二者變化趨勢(shì)較一致;轉(zhuǎn)膜PKC活性出現(xiàn)雙相改變,即傷后2～12h降低,傷后96h及以后升高(表1)。2.2燒傷后T淋巴細(xì)胞肌醇磷脂途徑胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子活性/濃度變化參與介導(dǎo)燒傷后T細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各分子活性變化較復(fù)雜,具體表現(xiàn)在與正常對(duì)照組相比胞漿PKC活性出現(xiàn)先升高(12h,P<0.01),后降低(96h,P<0.01)的雙相改變,與轉(zhuǎn)膜PKC變化趨勢(shì)相反,其活性改變與IL-10分泌呈負(fù)性直線相關(guān);PI-PLC活性和Ca++濃度傷后各時(shí)相均降低,但變化趨勢(shì)一致,二者均于傷后168h出現(xiàn)恢復(fù)(表2,表3)。2.3燒傷后T淋巴細(xì)胞功能活性與正常對(duì)照組相比較,燒傷后小鼠脾臟T細(xì)胞增殖能力減弱,明顯減弱出現(xiàn)于傷后12h,傷后24、96h顯著減弱,IL-2的分泌于傷后明顯降低,傷后24～168h降低有非常顯著性意義(P<0.001),IL-10的分泌出現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì),降低出現(xiàn)于傷后2～96h,升高出現(xiàn)在傷后168h及以后。相關(guān)分析結(jié)果(rCa++/IL-2=0.581,rPI-PLC/IL-10=0.753)表明:胞漿[Ca++]與IL-2分泌及PI-PLC活性與IL-10分泌呈非常顯著正相關(guān)。3損傷后t細(xì)胞功能變化與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的變化嚴(yán)重?zé)齻颊哂捎谄錂C(jī)體天然和獲得性免疫功能紊亂,其導(dǎo)致感染的易感性大大增加。天然免疫功能的損傷包括皮膚屏障的破壞,腸源性感染和巨噬細(xì)胞功能降低等;獲得性免疫功能的損傷則主要是對(duì)T淋巴細(xì)胞功能的破壞,包括T細(xì)胞IL-2分泌減少和增殖功能降低等。此外,燒傷后免疫紊亂還包括非特異性炎癥反應(yīng)亢進(jìn)和由此導(dǎo)致的諸多并發(fā)癥等。最近的資料顯示,動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)均證明,燒傷和創(chuàng)傷后機(jī)體T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-2降低,而IL-10、IL-4的產(chǎn)生卻增加,故由此推論,燒傷和創(chuàng)傷后可誘發(fā)機(jī)體TH1/TH2平衡破壞。眾所周知,IL-2是T細(xì)胞必需的生長(zhǎng)因子,而IL-10是機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要抑制因子,其抑制活性體現(xiàn)在對(duì)輔助細(xì)胞合成分泌IL-1β、IL-12(TH1細(xì)胞)的抑制和抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞功能等方面。即傷后機(jī)體細(xì)胞因子的分泌可以誘導(dǎo)和加重機(jī)體的免疫抑制。我們的實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了上述結(jié)果。具體表現(xiàn)為,嚴(yán)重?zé)齻蟪ＵT導(dǎo)機(jī)體TH1/TH2平衡偏向TH2型反應(yīng)為主(TH2細(xì)胞增殖分化增強(qiáng)而TH1細(xì)胞增殖分化減弱)。為探索傷后T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌改變(TH1/TH2平衡偏移)和功能受抑的分子機(jī)制,我們對(duì)傷后T淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性進(jìn)行研究。T細(xì)胞的活化和功能的執(zhí)行可以由絲裂原介導(dǎo),而在體內(nèi)更主要的是接受抗原遞呈細(xì)胞呈遞的抗原信號(hào)和MHC(Ⅰ、Ⅱ)類信號(hào),在共刺激分子如CD28作用下活化、增殖、分泌細(xì)胞因子,執(zhí)行相應(yīng)的免疫功能。T淋巴細(xì)胞活化過程涉及信號(hào)接收、跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)、胞內(nèi)傳導(dǎo)、信號(hào)入核和基因表達(dá)等多個(gè)方面。本研究以肌醇磷脂信號(hào)途徑為對(duì)象,探索嚴(yán)重?zé)齻骉細(xì)胞功能受抑的分子機(jī)制。全面分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn):①嚴(yán)重?zé)齻?T細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)處于T細(xì)胞活化信號(hào)流的“限速酶”地位,也即參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的G-Protein、PTK、轉(zhuǎn)膜PKC活性受抑是制約燒傷后T細(xì)胞活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的“瓶頸”。G-Protein、膜PTK傷后各時(shí)相和轉(zhuǎn)膜PKC傷后早期活性均降低,其變化趨勢(shì)與淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2分泌變化趨勢(shì)相一致;且該三個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶在諸多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中活性明顯降低的時(shí)相發(fā)生最早。②嚴(yán)重?zé)齻?PKC轉(zhuǎn)膜可以獨(dú)立于PI-PLC作用底物DAG。原因在于:PKC是由PI-PLC分解PIP2所產(chǎn)生底物DAG活化,為PI-PLC下游信號(hào)分子,其活性變化應(yīng)尾隨PI-PLC的活性變化,與同屬PI-PLC作用主物IP3介導(dǎo)的[Ca++]濃度相一致。但我們的研究結(jié)果顯示其活性變化早于PI-PLC和Ca++,提示存在有活化PKC的另外途徑,且說明PKC轉(zhuǎn)膜可以獨(dú)立于PI-PLC作用底物DAG。另外,轉(zhuǎn)膜PKC出現(xiàn)先降低后升高,其變化趨勢(shì)與IL-10分泌相一致,提示二者可能存在某種相關(guān)性。③燒傷后脾臟T淋巴細(xì)胞胞漿Ca++濃度降低可能是導(dǎo)致T細(xì)胞增殖活性降低和IL-2分泌減少的重要原因,但傷后168hCa