母親亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變和神經(jīng)管缺陷的關系

母親亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變和神經(jīng)管缺陷的關系

自1968年e.d.i.habgar和r.w.smhell首次發(fā)現(xiàn)落葉林缺乏與神經(jīng)管缺陷（ntd）有關以來，女性對懷孕期間添加落葉林是一個非常有效的預防ntd出生的非常有效措施之一，但其功能機制尚不清楚。亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)是1994年由Goyeffe等人首次克隆成功并定位于1p36.3。之后又發(fā)現(xiàn)MTHFR基因的677C→T突變會造成此酶活性下降及耐熱性降低,從而引起高半胱氨酸血癥,高半胱氨酸堆積又導致葉酸代謝的紊亂而與神經(jīng)管缺陷(NTD)的發(fā)生有一定的關系,鑒于國內對上述研究尚無報道,且我國NTD的發(fā)病率又很高,本文首次采用PCR?RFLP法對24個生過正常孩子的母親和27位生過NTD患兒的母親的MTHFRC677T突變情況進行了研究,以探討母親的該突變在NTD發(fā)生中的作用及婦女妊娠期定量補足葉酸已成為預防NTD出生的作用機制。數(shù)據(jù)和方法一、正常罪犯的dna標本哈爾濱市及大慶市各市級醫(yī)院收集到的曾生過NTD患兒的母親的DNA標本,共27份,正常對照組為曾生過正常孩子母親,共24份。配對要求孕婦年齡相差±5歲,孕周相差±2周,同民族,同居住環(huán)境,受教育程度相似。二、方法1.提取dns取靜脈血3mlACD抗凝,利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA,DNA濃度用紫外分光光度計測定。2.ccctgptgptgptgrtgatgrtgrtgrtgrt-pcr反應PCR擴增用DNA熱循環(huán)儀(Perkm?Elmer480),引物序列為:NCO351:5′?GGAGCAGGGAGCTTTGAGGC3′,NCO352:5′?CCCATGTCGGTGCATGCCTT3′反應體系為30μl,包括10×Buffer3.0μl,2.5mmol14×dNTP1.5μl,NCOL2μl,NCO22μl,TaqDNA聚合酶0.4μl(5U/μl),H2O19.1μl,基因組DNA2μl。反應條件首先是94℃預變性5分鐘,其后的30個循環(huán)為94℃30sec,62℃20sec,72℃60sec,循環(huán)結束再72℃延伸5分鐘。擴增后取10μlPCR擴增產(chǎn)物用0.2μlTaqI(10u/μl)消化過夜。3.上樣及溶液制備制備12%(交聯(lián)度29:1)非變性聚丙烯酰胺凝膠,100V預電泳30分鐘,取5μl酶解產(chǎn)物與1μl6×上樣緩沖液(0.25%溴酚藍,40%蔗糖)混勻后上樣,150V恒壓電泳34小時后揭膠。凝膠經(jīng)過固定(10%乙醇+0.5%乙酸,12分鐘)、染色(0.2%AgNO320分鐘)、顯色(1.5%NaOH+0.4%甲醛至清晰)三步處理后即可進行分析。三、顯著性的分析按HALDANE調整法計算相對發(fā)病風險RR,分析NTD與可能的風險因子(基因型VV或基因V)的相關性,并進行相應的顯著性x2統(tǒng)計檢驗(DF=1)。同時用列聯(lián)表方法分析標記基因V或基因型VV與疾病的關聯(lián)性,對關聯(lián)的顯著性采用YATES校正計算或雙側FISHER確切概率法計算(樣本數(shù)小于4O時)。以曾生過NTD患兒的母親作為風險人群對未曾生過NTD患兒的母親MTHFRC677T的突變頻率進行比較分析。采用PPAP軟件進行計算。結果一、種基因型的出現(xiàn)由于MFHFR677位點C被T置換后,可產(chǎn)生一個TaqI限制內切酶的酶切位點,所以PCR產(chǎn)物酶解電泳后,可分出三種基因型:純合A677/A677由于序列中無TaqI切點,所以電泳后只出現(xiàn)一條帶為134bp;純合子V677/V677可見二條帶,分別為75bp,59bp;雜合子A677/V677可見三條帶,分別為134bp,75bp和59bp(見圖1)。二、ntds組的v/v基因型及相對風險的相關性以曾生過NTD患兒的母親作為風險人群對生過正常兒童的母親的MTHFRC677T的突變頻率進行分析的結果(表1)為:正常對照組中V/V基因型的頻率為12.5%,而NTDs組中V/V基因型的頻率占33.3%。對V/V基因型分析,計算得到V/V基因型的母親比非V/V基因型的母親生出NTD患兒的相對風險提高近3倍(RR=3.15),該結果具有提示性顯著意義(x2=2.95,P<0.1)。進一步對V分析,計算得到攜帶V基因的母親比不攜帶V基因的母親生出NTD患兒的相對風險提高近5倍(RR=4.98),結果有提示性顯著意義(x2=3.42,P<0.1);用列聯(lián)表方法作關聯(lián)性分析,結果也具有提示性顯著意義(x2=2.12,P<0.1)。改變hcy的基因結構脊柱裂、腦積水和無腦兒是一系列由于神經(jīng)管未閉合引起的新生兒出生缺陷(NTD)。有關NTD的致病因素目前仍不清楚,國內外多數(shù)學者認為NTD是遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用的結果。最近,國外的研究發(fā)現(xiàn),在懷有NTD患兒的婦女血中有輕度高半胱氨酸(Hcy)水平上升的現(xiàn)象,而懷孕期間母體Hcy濃度輕度升高或蛋氨酸濃度輕度降低將會干擾神經(jīng)管閉合。導致Hcy在血中貯積的關鍵酶主要有三個:首先是N5甲基四氫葉酸半胱氨酸甲基轉移酶,此酶可催化Hcy甲基化變成蛋氨酸,但是它與NTD的關系未見報道。第二個關鍵酶是胱硫醚β?合成酶(CBS),它可催化Hcy與絲氨酸合成胱硫醚以減少Hcy的蓄積。Ramsboottcm等研究了一個嚴重影響CBS功能的突變C307S在正常群體和NTD群體中的出現(xiàn)頻率,結果他發(fā)現(xiàn)二者間無任何差別,因此他認為CBS等位基因的功能喪失與NTD無關。第三個關鍵酶就是N5,N10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR),它在半胱氨酸的代謝中有非常重要的地位,它催化N5,N10亞甲基四氫葉酸還原成N5甲基四氫葉酸,而后者將甲基轉給Hcy使其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必將導致Hcy向蛋氨酸的轉化發(fā)生障礙。自從1994年Goyette等成功地將MTHFR的cDNA分離出來后,對MTHFR的研究進一步深入。人們發(fā)現(xiàn)人群中MTHFR基因內存在一個多態(tài)位點,即677C→T的改變,由于該突變會造成此酶活性下降及耐熱性降低而導致葉酸代謝紊亂,被第一個認為是NTD的遺傳危險因素。Ou等人及Whitehead等人的研究都認為MTHFR基因677C→T多態(tài)是NTD的一個危險因素。本研究在選擇了匹配的對照組,并排除種族,地區(qū)的影響的情況下,通過對24位生過正常孩子的母親和27位生過NTD患兒的母親的MTHFRC677T突變情況進行了研究,結果發(fā)現(xiàn):母親的正常對照組中的V/V基因型頻率為12.5%,而NT