第四章DNA長度多態(tài)性1-RFLP

分子標(biāo)記的歷史第一代分子標(biāo)記RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性）第二代分子標(biāo)記

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性）第三代分子標(biāo)記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)限制性片段長度多態(tài)性RFLP限制性片段長度多態(tài)性RFLP

1RFLP技術(shù)的簡介2

RFLP的實(shí)驗(yàn)步驟

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RFLP技術(shù)在法醫(yī)物證學(xué)的應(yīng)用RPLF技術(shù)的簡介個(gè)體差異大多數(shù)都是由于不編碼蛋白的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域發(fā)生中性突變。這些突變構(gòu)成的差異成為DNA多態(tài)性。假如DNA順序中的某個(gè)堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的DNA序列產(chǎn)生（或缺失）某種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。這樣，利用該限制性內(nèi)切酶消化此DNA時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。

RPLF技術(shù)的原理利用特定的限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割不同生物個(gè)體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個(gè)片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與DNA探針進(jìn)行Southern雜交和譜帶顯示，即獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。RPLF分析圖譜的特異性決定于限制性內(nèi)切酶特異性和DNA探針特異性。RFLP的類型1.點(diǎn)的多態(tài)性表現(xiàn)為DNA鏈中發(fā)生單個(gè)堿基的突變，且突變導(dǎo)致一個(gè)原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。Southern雜交即可診斷。2.序列多態(tài)性由于DNA順序上發(fā)生突變?nèi)缛笔?、重?fù)、插入所致。RFLP技術(shù)的步驟Southern雜交轉(zhuǎn)膜凝膠電泳分開DNA片段酶切不同個(gè)體DNA的提取譜帶顯示基因座片段斷裂抽提DNA或PCR擴(kuò)增后的DNA經(jīng)內(nèi)切酶酶切,然后在瓊脂糖凝膠電泳分析，適合較大分子的DNA分析DNA先酶切，電泳分離，變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維膜，然后與同位素標(biāo)記的探針雜交，最后做放射自顯形，就可檢測出多態(tài)性條帶。實(shí)驗(yàn)步驟一、不同個(gè)體DNA的提取1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA；3.用有機(jī)試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì)。二、限制性核酸內(nèi)切酶消化一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時(shí)為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，樣本DNA必需充分消化，否則將影響分型結(jié)果。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離，必要時(shí)可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。

限制性核酸內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）是來源于細(xì)菌體內(nèi)的一類酶，能夠識(shí)別雙鏈DNA中特殊回文序列并且能在識(shí)別序列內(nèi)將DNA雙鏈切斷。多在原核生物中存在，能識(shí)別4～6個(gè)特苷酸特定的堿基序列。EcoRI把GAATTC在GA之間切開，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的結(jié)果產(chǎn)生不含粘性末端的平整末端，如HapI。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ選擇條件：限制酶活性穩(wěn)定；識(shí)別序列靠近VNTR序列的兩翼；特異性穩(wěn)定，條件易控制；DNA片段不易受甲基化的影響。兩斷端分別有突出的堿基個(gè)數(shù)稱為黏性末端兩斷端無突出的堿基個(gè)數(shù)稱為平端三、電泳分離原理：DNA是兩性電解質(zhì)，在同一電場強(qiáng)度下DNA片段長度與片段的遷移率成反比。在低壓恒定電壓下，將DNA樣品放在0.6～0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨3.0－23.0kp的DNA片段，故可對(duì)DNA片段進(jìn)行分離。分辨大片斷的DNA需要用濃度較低的膠，分辨小片段DNA則需要濃度較高的膠。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小，往往同時(shí)在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA（DNAmarker）進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠電泳四、印跡轉(zhuǎn)移概念：分離的DNA片段從凝膠上原位轉(zhuǎn)移到一張高機(jī)械強(qiáng)度的支持膜上，這個(gè)過程就叫印跡轉(zhuǎn)移。支持膜多用尼龍膜，常用的轉(zhuǎn)移方法為真空轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移完畢后，尼龍膜漂洗需用0.4mmol/LNaOH處理轉(zhuǎn)膜即將凝膠中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到固相支持物上。而此過程最重要的是保持各DNA片段的相對(duì)位置不變。DNA是沿與凝膠平面垂直的方向移出并轉(zhuǎn)移到膜上，因此，凝膠中的DNA片段雖然在堿變性過程已經(jīng)變性成單鏈并已斷裂，轉(zhuǎn)移后各個(gè)DNA片段在膜上的相對(duì)位置與在凝膠中的相對(duì)位置仍然一樣，故而稱為印跡（blotting）。用于轉(zhuǎn)膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（NC膜）、尼龍（Nylon）膜、化學(xué)活化膜和濾紙等，轉(zhuǎn)膜時(shí)可根據(jù)不同需要選擇不同的固相支持物用于雜交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。

五、分子雜交

基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。分類：鑒別DNA的分子雜交稱為Southern印跡雜交（Southernblot），待檢的對(duì)象是DNA片段；鑒別RNA的分子雜交稱為Northern印跡雜交（Northernblot），待檢的對(duì)象是RNA片段；鑒別蛋白的雜交稱為Western印跡雜交（Northernblot），待檢的對(duì)象是蛋白；實(shí)驗(yàn)步驟1預(yù)雜交：封閉固相濾膜上非特異性DNA結(jié)合部位，起到消除圖譜的背景信號(hào)的作用。2雜交：將尼龍膜置雜交管內(nèi)，加入含有探針的雜交緩沖液，進(jìn)行探針和靶DNA雜交。3洗膜：固相膜經(jīng)漂洗，去除雜交膜上未與靶DNA雜交的多余的探針，降低圖譜的背景信號(hào)。離子強(qiáng)度越低，溫度越高，雜交的嚴(yán)格程度越高，也就是說，只有探針和待測順序之間有非常高的同源性時(shí)，才能在低鹽高溫的雜交條件下結(jié)合。多基因探針在低強(qiáng)度雜交洗膜的條件下進(jìn)行，5×SSC洗膜液，溫度55°C。單基因探針在高強(qiáng)度雜交洗膜的條件下進(jìn)行，0.1×SSC洗膜液，溫度65°C。探針組成：特異性單鏈DNA和標(biāo)記分子特異性單鏈DNA：小衛(wèi)星DNA的核心序列串聯(lián)形成的多聚體，分為單基因探針和多基因探針。單基因探針：要求所測基因座的多態(tài)性高，探針特異性高能與靶片段的等位基因穩(wěn)定雜交。多基因探針：VNTR基因座核心序列具有同源性，探針特異性低，可與多個(gè)VNTR基因座基因雜交。探針標(biāo)記：標(biāo)記、探針、靶DNA形成一體，經(jīng)標(biāo)記分子檢測可以確定靶基因片段位置

六、譜帶顯示原理：酶標(biāo)記物的顯示是通過酶反應(yīng)耦聯(lián)化學(xué)發(fā)光的技術(shù)。酶反應(yīng)的發(fā)光底物被氧化劑及標(biāo)記酶催化，氧化成激發(fā)分子狀態(tài)，在躍遷回基態(tài)時(shí)釋放出分子，能被使X光片感光。含義：在雜合子中一條帶表示一個(gè)等位基因，在純合子中表示兩個(gè)相同的等位基因。在DNA指紋中，一條帶表示不同基因座相同長度的基因片段。

RFLP技術(shù)的應(yīng)用1.鑒定是否是需要的