綜合實訓材料

PAGEPAGE7實驗一：多粘菌素B的發(fā)酵培養(yǎng)一、實驗目的：1掌握多粘菌素B生產(chǎn)菌株的分離純化和保藏。2掌握多粘菌素B接種，擴配培養(yǎng)和搖瓶發(fā)酵技術。3掌握多粘菌素B在3L發(fā)酵罐上中的培養(yǎng)技術。4掌握HPLC或杯碟法的檢測技術。二、實驗原理：多粘菌素B是由多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolym．yxa)產(chǎn)生的一種由氨基酸和脂肪組成的堿性鎖環(huán)狀多肽類抗生素，對革蘭氏陰性桿菌有較強的抑制或殺菌作用，多粘類芽孢桿菌為好氧發(fā)酵，本實驗主要采用搖瓶和發(fā)酵罐進行發(fā)酵培養(yǎng)。三、實驗材料與方法：1）菌種：多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus，polymyxa)，-80℃冰箱，甘油管保藏（本實驗室保存）。2）培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件：(1)斜面培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，蛋白胨8%，牛肉粉0.3%，NaC10.5%，瓊脂1.5%，消后pH6.8。30℃培養(yǎng)24h。配200ml，試管裝5ml×3支，余下裝一個三角瓶。單孢子液涂平板，培養(yǎng)24小時，得母斜面。挑母斜面上的單菌落傳子斜面培養(yǎng)24小時。(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，蛋白胨0.55%，牛肉粉0.7%，NaC10.3%，pH=6.8。配200ml，裝25ml/250ml瓶×4瓶，200rpm、30℃培養(yǎng)24h。移出標準：pH6.6-6.8，OD650=1左右。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉3%（先糊化），葡萄糖1.5%，玉米漿0.3%，(NH4)2SO40.2%，NaCl0.06%，KH2PO40.08%，MgSO40.02%，CaCO31%，泡敵0.02%，消前pH7.5-8.0，消后pH6.8。30℃。搖瓶發(fā)酵：配200ml，裝50ml/250ml瓶×4瓶，接種2ml，200rpm，培養(yǎng)48h。3L發(fā)酵罐：裝2L，接種量1%，300-650rpm，通氣比≥1.0vvm（0.10-0.25m3/h），DO≥10%，pH≥6.3，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)基滅菌：121℃、15min。注意點：淀粉一定要單獨糊化；先調(diào)pH，最后加CaCO3。3）實驗準備（每組）：1ml移液管15支，5ml移液管5支，培養(yǎng)皿1包，20玻璃珠+20ml生理鹽水裝三角瓶，9ml生理鹽水試管8支，6ml細菌培養(yǎng)基試管3支，15ml細菌培養(yǎng)基試管3支，牛津杯12個。種子培養(yǎng)基250ml三角瓶4個，發(fā)酵培養(yǎng)基250ml三角瓶4個。4）實驗儀器：3L發(fā)酵罐，滅菌鍋，pH計，天平，磁力攪拌器，顯微鏡，分光光度計。四、檢測方法：1）樣品制備：取發(fā)酵液10ml，加熱至100℃，離心或過濾，取上清，用于效價檢測。2）杯碟法（生物檢定）枯草芽孢桿菌/大腸埃希菌作檢定菌，在培養(yǎng)皿中倒入15ml普通細菌培養(yǎng)基，待其凝固后再倒入6ml混有枯草芽孢桿菌孢子的細菌培養(yǎng)基，凝固后即得到細菌平板。取發(fā)酵液離心（6000rpm，4min）得到的上清液200μl，注入牛津杯（直徑為7.5mm）中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18h后，測量抑菌圈的直徑，通過與相近濃度標樣的對比，計算產(chǎn)物的生物效價。（每組3皿，培養(yǎng)基21ml/皿生物檢定培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸膏粉1，葡萄糖5，硫酸銨1，瓊脂20。90mm培養(yǎng)皿下層倒入15ml培養(yǎng)基，上層為混有100μl檢定菌液的6ml細菌培養(yǎng)基。檢定菌的制備：枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)（20g葡萄糖、15g蛋白胨、0.5g牛肉膏、5g氯化鈉，1L蒸餾水，36℃振蕩培養(yǎng)14h），加20顆玻璃珠，放置搖床200rpm，10min，制成單孢子懸液（107個/ml），4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?0ml/250ml瓶×1瓶）多粘菌素B標準溶液配制：0.6g/L、0.9g/L、1.2g/L、1.5g/L。3）HPLC分析條件：色譜柱：YMC-PackODS-A（5μm,12nm）250×4.6mmI.D.或：Kromasil100-3.5-C18(4.6x150mm)流動相：31.4mM硫酸鈉-磷酸（pH2.3）/乙腈（80/20）流速：1.0ml/min，檢測波長：215nm，溫度：30℃每次進樣量：20μl（0.5mg/ml）

實驗二：硫酸多粘菌素B的提取制備實驗一、實驗目的：1、了解有機溶劑萃取與反萃取的原理；2、掌握萃取的操作要點；3、了解多粘菌素B提取制備的工藝過程；4、學會如何根據(jù)產(chǎn)物的特性，選擇和確定提取方法。二、實驗原理：多粘菌素B系由多粘芽胞桿菌產(chǎn)生的一組多肽類抗生素，屬于胞外產(chǎn)物。常用其硫酸鹽，結構如下圖，為白色結晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇，有引濕性。在酸性溶液中穩(wěn)定（pH2.0～7.0），其中性溶液在室溫放置一周不影響效價，100℃時放置數(shù)小時幾乎不破壞；堿性溶液不穩(wěn)定，當pH＞7時，很快失效，失效時僅發(fā)生立體結構的改變和分子內(nèi)重排。目前，對多粘菌素B的提取主要有以下3種方法：溶媒萃取法：在堿性條件下將多粘菌素B轉入有機溶劑，如丁醇（正丁醇）中，可考慮加硫酸銨或氯化鈉作為鹽析劑以提高萃取效果，然后再在酸性條件下反萃取到水相。此法要點：堿性條件下的萃取操作要快，溫度要低，時間盡量短，減少有效成份的破壞。離子交換法：利用多粘菌素為高價堿性化合物的性質(zhì)，可用羧基陽離子樹脂進行提取。濾液在pH3.5～9.0下吸附，解析劑采用酸性電解液，濾液在pH6.0～7.0下吸附更有利于去除雜質(zhì)。使用非離子聚苯乙烯樹脂來吸附濾液，用有機溶劑的水溶液來解析，解吸液質(zhì)量明顯提高，提取收率可達到80%。泡沫分離法：泡沫分離法是以氣泡為介質(zhì)，利用組分的表面活性差進行分離的一種分離方法，收率高達86～95％。該方法的使用局限性較大，對發(fā)酵液質(zhì)量有較高的要求。分離條件：SDS（十二烷基硫酸鈉）0.06g/L，pH4.0～5.0，氣速220ml/min，多粘菌素：SDS=2：1。本實驗采用溶媒萃取法提取純化多粘菌素B發(fā)酵液。三、實驗儀器和試劑正丁醇（工業(yè)級）/乙酸乙酯、99%以上乙醇（工業(yè)級）、濃鹽酸或草酸、濃氨水或氫氧化鈉溶液、稀硫酸。離心機，旋轉蒸發(fā)儀，磁力攪拌儀，pH計，500ml、1000ml分液漏斗，燒杯，HPLC檢測或杯碟法檢測。四、實驗過程預處理：取發(fā)酵液，加鹽酸或草酸調(diào)pH2.0，加熱至100℃（80-100℃），保溫20min，離心或過濾（硅藻土或珍珠巖），收集濾液，80℃、-0.01MPa下真空濃縮，濃度2g/L以上。萃?。?.5BV正丁醇+濃縮液，10℃下，加氨水或堿液調(diào)pH10-12，振搖3-5min，靜置10-15min，棄水相，0.2BV純水洗滌，棄水相。反萃取：加1BV純水，稀硫酸調(diào)pH2-3，室溫，振搖5min，靜置15min，收集水相。真空濃縮，濃度要求3g/L以上。結晶：室溫下，緩慢加入乙醇，攪拌，剛出晶時記下乙醇體積數(shù)，再加3倍體積乙醇，水浴降溫至0-5℃，冷置3-8h，過濾，干燥，取樣檢測。以上每一步都需要檢測，每一步需計錄收率和質(zhì)量。五、實驗結果 六、完成實驗報告并討論。（每一部分：過程現(xiàn)象、結果與討論應詳寫）七、有條件可進行離子交換法和泡沫分離法的實驗，并對比3種方法的優(yōu)缺點。實驗三啤酒酵母擴培一、實驗目的：1、了解啤酒酵母的擴配的原理2、掌握啤酒酵母的擴配的方法二、實驗原理：用于釀造啤酒的酵母。多為釀酒酵母（Sac-charomycescerevisiae）的不同品種。E．C．Hansen（1883）開始分離培養(yǎng)酵母并將它用于釀造啤酒。丹麥Carlsberg釀造研究所的下面酵母是有名的。細胞形態(tài)與其它培養(yǎng)酵母相同，為近球形的橢圓體，與野生酵母不同。啤酒酵母是啤酒生產(chǎn)上常用的典型的上面發(fā)酵酵母。菌體維生素、蛋白質(zhì)含量高，可作食用、藥用和飼料酵母，還可以從其中提取細胞色素C、核酸、谷胱甘肽、凝血質(zhì)、輔酶A和三磷酸腺苷等。在維生素的微生物測定中，常用啤酒酵母測定生物素、泛酸、硫胺素、吡哆醇和肌醇等。三、實驗用品：上面酵母發(fā)酵麥汁培養(yǎng)基：YPDA：葡萄糖2%(分消)，蛋白胨2%，酵母提取物1%，瓊脂2%，pH6.8，120℃，15min滅菌。四、實驗過程：1、原菌活化：原菌試管保存的菌種常用兩種方法，普通斜面試管和灌注液體石蠟的斜面試管。普通斜面試管，用接種環(huán)取1-2環(huán)菌苔接入10ml液體麥汁試管中(麥汁濃度為12oP，滅菌)活化一次。如用灌注液體石蠟的斜面試管，須活化兩次。第一次活化36-48h，再接入第二只液體麥汁試管，接種量為lml，培養(yǎng)24-36h后轉接，上面酵母27℃培養(yǎng)，下面酵母25℃培養(yǎng)。菌種培養(yǎng)期間，每4h將試管在手掌心中敲擊80～100次。2、平板分離：從活化的液體麥汁試管取樣，單孢稀釋，涂于10-12oP的固體麥汁培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度同前，72-96h得單菌落。選擇生長快，比較大，乳白色，邊緣整齊的正常菌落，用于接種。3、擴培1：選擇4-6個單菌落，接入10ml液體麥汁試管中，搖動至菌苔擴散，充分吸氧。培養(yǎng)溫度同上，培養(yǎng)24-36h，每4h將試管在手掌心敲擊80-100次。4、擴培2：由液體試管轉入250ml三角瓶、1L三角瓶、5L三角瓶逐級擴培。裝量50%，麥汁濃度為12oP，滅菌。接種量保持在1：(8-10)，1：(6-8)，1：(4-6)，培養(yǎng)溫度依次下降1-2℃，培養(yǎng)18-24h，每4h搖動一次，每次1-2min，以充分吸氧，并將CO2釋出。5、擴培3：若種酵母量不夠用，用密閉不銹鋼桶或卡氏罐再擴培一級，工藝條件同前。6、發(fā)酵培養(yǎng)：種酵母接入發(fā)酵罐后，與麥汁的比例≤1：10，最好在1：3-5。方案：打入發(fā)酵罐1/2的麥汁，接入種酵母，接種后保溫通風發(fā)酵，至指數(shù)生長期，另加入1/2麥汁至滿灌。滿罐后保溫通氧發(fā)酵。酵母沉降可以重復使用7代左右。7、逐級擴培酵母所應達到的技術指標：擴培中注意無菌操作，通氣量的大小、擴培比例，培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度等因素的影響。每次接種前無菌操作取樣檢查菌體數(shù)量、死亡率、發(fā)芽率等，達到工藝要求后，轉入下一級培養(yǎng)。 生物專業(yè)綜合實訓計劃〈一〉、多粘菌素B第一天：講解布置，配制斜面、種子、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，包扎移液管、培養(yǎng)皿、玻璃珠、裝9ml生理鹽水試管，滅菌后，出發(fā)菌株稀釋涂平板（10-4-10-6），培養(yǎng)24小時。第二天：傳接子斜面，培養(yǎng)24小時。配制檢定培養(yǎng)基、細菌培養(yǎng)基，兩包槍頭，滅菌備用。第三天：接搖瓶種子（中午或下午），培養(yǎng)24小時。第四天：接搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)48小時。第六天，放瓶，測OD、鏡檢、生物效價檢測。發(fā)酵液處理。接搖瓶種子。第七天：配制3L發(fā)酵罐培養(yǎng)基，滅菌，接種培養(yǎng)48小時，三班倒，過程調(diào)節(jié)控制、取樣觀察檢測記錄。第九天：放罐，測OD、鏡檢、生物效價檢測。發(fā)酵液處理。