正相色譜法分離純化紫杉醇工藝研究

正相色譜法分離純化紫杉醇工藝研究

紫杉醇是一個從蘑菇科植物中分離出來的二氧化合物。具有獨特的抗癌機制。這是繼阿霉素和鉑之后的熱點抗癌藥物。1992年，美國食品和藥物管理局（f）批準其作為抗晚期胃癌藥物上市。紫杉醇在中國被用作兩類西藥。1995年10月，中國科學院藥物研究所和?？谥扑帍S獲得了藥品許可證，并成為中國世界上第二個正式生產(chǎn)紫杉醇及其注射液的國家。目前，在美國、英國和荷蘭等40多個國家，紫杉醇是一種重要的抗高血壓藥物。目前，世界上約600公斤紫杉醇原藥，年銷售額超過30億元人民幣。目前,藥用紫杉醇獲取主要來源于天然植物——紅豆杉的提取,由于這些植物數(shù)量極少,種群密度小,自身繁殖度低,生長緩慢,且紫杉醇在這些植物樹皮中的含量又極低,僅從天然植物——紅豆杉中獲取紫杉醇必將給紅豆杉屬植物在自然界中的長期留存帶來極大的危險.在這種情況下,人們利用現(xiàn)代科技手段,正在為充分有效地利用現(xiàn)有的資源獲得具有獨特抗癌機制的天然產(chǎn)物——紫杉醇而努力.正相色譜過程分離純化紫杉醇工藝的突出優(yōu)點是固定相價格低廉,用硅膠作為固定相即可,而且洗脫所用流動相多為揮發(fā)性很強的有機溶劑,溶劑回收簡單、能耗低.鑒于正相色譜的這些優(yōu)點,開發(fā)一種適合我國實際情況的紫杉醇分離純化工藝,具有很大的社會和經(jīng)濟效益.1材料和方法1.1氣相色譜-質(zhì)譜hplc-msp本研究以規(guī)模制備為背景,所用的有機溶劑均為市售的工業(yè)品,使用時自行精制除去不揮發(fā)殘留.實驗用細孔100目硅膠,購自上海硅膠廠,拌樣用硅藻土采用上海金山漕涇化工廠,120目.分析檢測用TLC法結(jié)合HPLC法,TLC法采用EMERCK公司生產(chǎn)的鋁制60F254硅膠板,板上硅膠厚度0.2mm,HPLC為島津SCL—14Avp液相色譜儀,檢測器型號SPD—10Avp.流動相(體積比)甲醇∶水(65∶35),流速1.0mL/min.表1和圖1分別為紅豆杉浸膏樣品色譜圖譜及色譜圖譜的積分面積結(jié)果.1.2樣品的預處理浸膏樣品中含有大量雜質(zhì),它們在液相色譜固定相上的競爭性吸附甚至不可逆吸附會導致固定相用量增加,目標產(chǎn)物的分離度降低,分離效率低下等,因此,在分離純化的早期階段就使用色譜過程是不經(jīng)濟的.對樣品選擇合適的方法進行預處理,提高目標產(chǎn)物的濃度,在生產(chǎn)率和操作控制方面都會帶來必要的方便.1.2.1固液萃取去除非極性雜質(zhì)浸膏樣品來源于樹皮、枝葉或植株體的其他部位,除含量很低的目標產(chǎn)物紫杉醇外,還含有各種類型的極性和非極性雜質(zhì).在獲得浸膏的粗提過程中,已去除一大部分雜質(zhì),但仍有相當部分帶入進來.這部分雜質(zhì)中,一些低極性或非極性類雜質(zhì)如焦油等,會黏附在作為色譜固定相的硅膠上,使硅膠失去吸附能力,而且隨流動相洗脫夾帶下來后,又會給洗脫餾分的干燥帶來困難.對于這類雜質(zhì),可采用低極性的醚類和烷類有機溶劑進行固液萃取除去.本研究采用正己烷(60～90℃)對浸膏進行固液萃取.其結(jié)果見圖2.隨正己烷用量的增加,萃取的雜質(zhì)百分率也在增加,但當正己烷的用量達到原始浸膏的5倍時,被萃出的雜質(zhì)百分數(shù)則不在有明顯變化.因此,萃取液與紫杉醇浸膏的質(zhì)量比,5倍體積的正己烷可以認為是一個優(yōu)化的值.綜合以上研究,可得固液萃取除去非極性雜質(zhì)的優(yōu)化條件是:在溫和的勻漿攪拌條件下,按體積質(zhì)量比5倍體積的正己烷可除去10%～12%的雜質(zhì).固液萃取過程目標產(chǎn)物紫杉醇的收率為100%.1.2.2等體積堿洗前后浸膏堿洗效果的比較將經(jīng)正己烷固液萃取后的浸膏樣品用一定濃度的Na2CO3溶液洗滌.由于植株體中含有大量鞣質(zhì)酸等其他一些酸類雜質(zhì)易和堿溶液發(fā)生一種類似皂化的反應,生成一些易溶于水的物質(zhì),可以通過用水洗滌除去.但紫杉醇在堿性環(huán)境中極其不穩(wěn)定,很快裂解成巴卡亭Ⅲ和其他一些物質(zhì).基于這一事實,本研究中采用乙酸乙酯做溶劑,用0.5mol的Na2CO3溶液裂解紫杉醇預計制備少量巴卡亭Ⅲ的過程中發(fā)現(xiàn),紫杉醇在堿洗的前后沒有發(fā)生任何變化,這一裂解反應沒有達到預期目的,但為紫杉純的純化找到了一種切實可行的方法.可以認為乙酸乙酯作為溶劑的水解反應可以屏蔽紫杉醇的裂解反應.圖3為不同濃度Na2CO3溶液對經(jīng)正己烷固液萃取后浸膏樣品進行堿洗的結(jié)果,浸膏用10倍體積的乙酸乙酯溶解,加入等體積堿溶液.圖中顯示,Na2CO3濃度增加時,被去除雜質(zhì)的百分率也增加,但當Na2CO3溶液濃度增加到0.5mol以上后,再增加則無明顯影響.而且,由于酯的水解,Na2CO3濃度過高使有機溶劑消耗量變大,因此,0.5mol較為合適.同樣,堿溶液用量也有類似影響,根據(jù)實驗結(jié)果,以等體積較好.作為最為直接的證據(jù),將堿洗前后浸膏樣品的圖譜結(jié)果見圖4、5.比較圖4和圖5可知,堿洗前后浸膏樣品的圖譜幾乎沒有變化,可知堿洗主要除去一些在227nm或233nm處沒有吸收峰的雜質(zhì),而紫杉醇則不受影響.堿洗過程具體操作為:用10倍體積乙酸乙酯溶解適量浸膏;加入等體積0.5mol的Na2CO3溶液,攪拌10～20min:分相后,有機相用0.5倍Na2CO3溶液體積的蒸餾水洗滌2次.其中第二次洗滌常伴有乳化現(xiàn)象,需加入適量鹽,過程中乙酸乙酯因水解大約損失一半;洗滌后有機相用無水硫酸鈉進行脫水,根據(jù)后面工序的需要減壓濃干或濃縮至25%～30%的有機相體積.這一步驟可去除最高達60%的雜質(zhì)(以正己烷固液萃取后干浸膏量為基準),因乙酸乙酯少量溶于水使紫杉醇有所損失,收率在97%以上.1.3紫杉醇的色譜分離純化堿洗濃縮后的產(chǎn)物,除一些難以去除的色素外,雜質(zhì)含量主要是一些紫杉烷類化合物,其中不乏價值很高的紫杉醇類似物如Cephalomannine,巴卡亭Ⅲ等,同樣需要分離純化.在一個工序中能分段收集這些化合物,層析過程是最佳選擇.因為目標產(chǎn)物的含量還很低,尤其伴隨有結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的類似物Cephalomannine,一次層析將紫杉醇純化到預定的純度難度很大,而且也不經(jīng)濟.比較合理的方法是,先用一個層析過程粗分一下,使收集的餾分中目標產(chǎn)物有較高的含量,為進一步分離純化奠定基礎(chǔ).因為這步層析僅是粗分,對色譜柱高徑比的要求不是太大,硅膠用量也不必太高,而且可以使用較高的洗脫速度.1.3.1流動相的選擇洗脫過程中可以通過采用極性較強的溶劑和極性較低的溶劑混合調(diào)整極性來改變洗脫強度.因為浸膏樣品中紫杉烷類物質(zhì)種類多,極性差別很大,以梯度洗脫較為合適.但連續(xù)梯度操作非常煩瑣,考慮到實際操作的方便,采用分段梯度操作最為適宜.丙酮和己烷均易揮發(fā),且均屬于無毒的有機溶劑,回收容易.本研究選擇己烷/丙酮體系為流動相.1.3.2粗沙/玻璃珠的制備經(jīng)上述除理的樣品在己烷/丙酮作為流動相的洗脫劑中溶解度不是很大,以固態(tài)上樣法較為合適.其樣品制備操作如下:將樣品按1∶10(g/mL)的比例溶解在丙酮中,然后加入5倍量(以浸膏樣品質(zhì)量為基準)的硅藻土,拌勻后自然風干.或?qū)⒃摶旌衔镌?0℃以下烘干即得固體樣品.洗脫操作時,將樣品放在色譜柱上部,并在樣品上端覆蓋一層粗沙或玻璃珠,以防止樣品界面被破壞.待洗脫.1.3.3洗脫結(jié)構(gòu)及條件洗脫模式可選用干柱色譜法進行初步估計.干柱色譜法是將干的吸附劑裝入色譜柱中.將待分離的樣品配成濃溶液或吸附于少量填料上,然后上樣.當洗脫液依靠毛細作用從柱上流下,接近色譜柱底部時,停止洗脫,將吸附劑分段從或根據(jù)色帶位置挖出或切開,用適當?shù)娜軇┫闯?這種方法溶劑消耗量少,所需時間短,可根據(jù)目標產(chǎn)物在柱中的位置確定洗脫模式.圖6是不同流動相洗脫條件下目標產(chǎn)物紫杉醇在柱中的位置,圖6僅是一個示意圖,只顯示了紫杉醇色斑的大致位置,雜質(zhì)的色斑沒有繪出.本研究采用的色譜柱是由容量為10mL,內(nèi)徑10mm,高接近7cm的醫(yī)用針管制成.上樣量0.1g,溶于1mL丙酮,拌入0.5g硅藻土,風干,柱內(nèi)硅膠分段洗脫后用TLC分析確定色斑位置.圖6中橫坐標表示色譜柱的軸向位置,最小刻度對應柱的下端出口,流動相為正己烷/丙酮體系,其比例(體積比)見圖6.根據(jù)圖6,可大致判斷一下洗脫梯度的模式,在己烷/丙酮為8∶2時,紫杉醇的譜點幾乎不移動,到7∶3時,紫杉醇能夠被洗脫,但譜點移動速度很慢,如果己烷/丙酮體積比加達到6∶4,紫杉醇斑點接近柱出口端,表示6∶4的己烷/丙酮對紫杉醇有足夠的洗脫強度.至此,洗脫結(jié)構(gòu)可初步設定為,以8∶2或7∶3的己烷/丙酮起始,洗脫一些吸附能力較差的色素和一些極性較低的紫杉烷類物質(zhì),以6∶4完全洗脫紫杉醇后結(jié)束.為使譜帶更好的分離,可以根據(jù)實驗結(jié)果在中間加入合適的梯度.考慮到有一些極性很強的紫杉烷類物質(zhì)如DAB等,可在6∶4的梯度結(jié)束后,再進行一次洗脫強度更大的梯度以回收副產(chǎn)物,最后用純丙酮代潛硅膠循環(huán)使用.在洗脫模式初步確定后,可進行實驗進一步確定洗脫模式.本研究實驗采用的色譜柱:內(nèi)徑16mm,柱軸向高度200mm,柱下端有旋塞;硅膠用量5g,采用敲擊裝填法干法裝柱,堆密度按0.5g/mL計,柱有效床層為l0mL;上樣量為0.5g,5mL丙酮溶解,拌入2.5g硅藻土,風干;洗脫速度用氣壓球控制在2mL/min.最佳操作模式:一次層析中洗脫模式的優(yōu)化選擇為:2BV(bedvolumn)70∶30+3BV65∶35+3BV60∶40(正己烷:丙酮).最后,根據(jù)浸膏樣品中回收副產(chǎn)物要求,可適當再增加洗脫梯度.1.3.4難以進行下一步分離一次層析過程中固定相的合適用量可以用硅膠和處理的浸膏質(zhì)量比作為參數(shù)進行表征.硅膠用量太小,分離效率低,各餾分之間交叉較多,難以進行下一步分離;而硅膠用量太大,在達到粗分的前提下又會造成浪費.按照下操作過程(結(jié)晶)的要求,該層析過程中要求目標產(chǎn)物紫杉醇的純度要在30%以上,而且要求紫杉醇所在餾分和前后餾分的交叉要盡可能小,否則影響下一次操作的收率.該一次層析過程,硅膠用量與浸膏質(zhì)量比為10∶1時效果最佳.研究表明,有限的增加硅膠用量難以有效提高一次層析的效果,只會使溶劑消耗量增大.1.3.5柱切換技術(shù)的應用如果直接將樣品加在色譜柱柱頂,除了洗脫時會增加柱壓外,在第一次操作結(jié)束,進入下一個循環(huán)時,需要取出上一次承載樣品的硅藻土,非常煩瑣,尤其在大規(guī)模生產(chǎn)時,頻繁拆裝色譜柱會影響生產(chǎn)進程.柱切換技術(shù)可以解決這一問題,將色譜柱設計成兩段,一段較短粗,負載承載浸膏樣品的硅藻土,另一段高徑比較大,是層析過程的有效段.洗脫過程中在線或間隔檢測洗脫液,發(fā)現(xiàn)負載樣品的柱段中沒有目標產(chǎn)物時,可用一個轉(zhuǎn)換閥直接將流動相導入層析過程的有效段,同時拆裝樣品柱,裝載下一次樣品.由于承載樣品用的硅藻土是一種失活的吸附劑,少量流動相便可以將目標產(chǎn)物洗脫完全.實驗中發(fā)現(xiàn),當硅藻土用量和浸膏比為5∶1時,按前面優(yōu)化的洗脫結(jié)構(gòu),用3BV硅藻土床層體積的流動相便可以將目標產(chǎn)物完全洗脫.層析因硅膠的不可逆吸附使目標產(chǎn)物有所損失,其收率約為95%.1.4紫杉醇的結(jié)晶、分離、萃取工藝在甲醇/水體系中的分離和利用粗分后目標產(chǎn)物能否進行結(jié)晶是衡量粗分結(jié)果的標準.結(jié)晶體系可以選用甲醇/水或乙醇/水,但乙醇對紫杉醇的溶解能力較差,處理量小,以甲醇/水體系較佳.將一次層析中含目標產(chǎn)物紫杉醇的餾分蒸干后,按8mL/g的比例溶解在甲醇中,水浴加熱到50℃,同時在攪拌的情況下緩緩滴入三分之一甲醇體積的雙蒸水,冷卻48h以上可得呈白色發(fā)黃的針狀晶體,這一步紫杉醇的純度可達50%～70%,收率95%以上.將結(jié)晶后母液用適量乙酸乙酯萃取,脫水蒸干后,與下一批物料累積循環(huán)處理,可提高總收率.1.5cephal婦人nine的溴加成反應Cephalomannine是紫杉烷類物質(zhì)中結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與紫杉醇最為相似的物質(zhì),非常難以分離,但它們?nèi)杂幸恍┛晒├玫牟煌?在溫和條件下,Cephalomannine易發(fā)生溴加成,而紫杉醇則無此反應.利用Cephalomannine和紫杉醇結(jié)構(gòu)中的這一差異,采用溴加成的方法改變Cephalomannine其分子的極性,可大大降低Cephalomannine和紫杉醇分離的難度.Cephalomannine的溴加成反應是可逆的,在乙酸條件下,用鋅粉就可以將Cephalomannine還原回來,這一點是臭氧化工藝所不能比擬的.反應以在氯仿中進行為好,但氯仿的儲存過程一般要加入乙醇作穩(wěn)定劑,否則易分解產(chǎn)生光氣.乙醇的存在使反應無法進行,所以對氯仿要進行處理.用濃硫酸洗滌氯仿,然后用水洗滌2次,無水硫酸鈉對氯仿相進行脫水后最后進行蒸餾,可得不含穩(wěn)定劑的氯仿.溴加成具體的操作為:按1/30(g/mL)的比例將一次層析得到的粗品加入氯仿中溶解,攪拌情況下快速滴入少量溴素,室溫下反應5min停止;用10%的Na2S2O3溶液淋洗去除未反應掉的溴素;用水或鹽水淋洗兩次,無水硫酸鈉脫水后蒸干,樣品進入下一個工序.圖7和圖8是溴加成前后樣品圖譜的比較,從中可以體會到溴加成的效果.溴加成的收率為95%.1.6紫杉醇的手性異構(gòu)體Cephalomannine經(jīng)溴加成后的產(chǎn)物極性發(fā)生了變化,需再經(jīng)一次硅膠色譜柱實現(xiàn)和紫杉醇的分離.選用毒性較小的己烷/乙酸乙酯為洗脫體系.此時的樣品中雜質(zhì)除一些色素和Cephalomannine溴加成后的產(chǎn)物外,還常常含有一種紫杉醇的手性異構(gòu)體7—epi—taxol,它7位的基團和紫杉醇呈手性異構(gòu),性質(zhì)非常相似.研究發(fā)現(xiàn),當色譜柱的長徑比在8∶1以上,干法裝柱,固定相硅膠用量和樣品的質(zhì)量比為30∶l時,紫杉醇和7—epi—taxol能夠?qū)崿F(xiàn)較好的分離.洗脫模式用干柱色譜結(jié)合小規(guī)模實驗證實以己烷/乙酸乙酯60/40(3BV)～55/45(2BV)～50/50(5BV)為佳.從最初的正己烷固液萃取到溴加成后,樣品量已經(jīng)很小,所以二次層析過程中的固定相用量和