米曲霉10214發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件優(yōu)化

米曲霉10214發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件優(yōu)化

中立酶是第一個發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于生產(chǎn)的工業(yè)酶劑。它在皮膚感、皮質(zhì)、絲綢、食品、藥物、裝飾等方面得到了廣泛應(yīng)用，尤其是在食品和制藥行業(yè)。但中性蛋白酶成本高、產(chǎn)量低等因素限制了其大規(guī)模生產(chǎn)。因此,對該酶類生產(chǎn)技術(shù)的研究得到了廣泛關(guān)注。微生物蛋白酶,主要由細(xì)菌、霉菌,其次由放線菌、酵母菌生產(chǎn)。米曲霉的酶系復(fù)雜,胞內(nèi)酶有氧化還原酶等;分泌的胞外酶有蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、果膠酶、谷氨酰胺酶、纖維素酶、半纖維素酶等。米曲霉是醬油釀造中的常用生產(chǎn)菌株,具有很強的糖化淀粉和分解蛋白質(zhì)的能力,醬油釀造的過程,就是利用種曲培養(yǎng)米曲霉,使其能夠大量繁殖,分泌多種酶,其中最為主要的是蛋白酶和淀粉酶。其中,蛋白酶活性的高低對于保證產(chǎn)品品質(zhì)、提高原料利用率和控制生產(chǎn)成本具有重要作用。1培養(yǎng)基和試劑菌種:米曲霉40214(CICC);干酪素、營養(yǎng)瓊脂、蛋白胨、牛肉粉、酵母浸粉:北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;氯化鈉、氯化鈣、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水碳酸鈉、三氯乙酸、福林酚試劑(分析純):西隴化工股份有限公司。1.2u3000儀器單人潔凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司;722型分光光度計:上海儀分科學(xué)儀器有限公司;雷磁PHS-3CpH計:南京互川電子有限公司;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋:浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;DKZ電熱恒溫震蕩水槽、電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海-恒科學(xué)儀器有限公司;80-2離心機:上海浦東光學(xué)儀器廠。1.3米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法1.3.1米曲霉初始發(fā)酵條件種子培養(yǎng)基:蔗糖30.0g,NaNO33.0g,MgSO4·7H2O0.5g,KCl5.0g,FeSO4·4H2O0.01g,KH2PO41.0g,瓊脂15.0g,加入蒸餾水1000mL,在pH6.0~6.5,121℃、0.1MPa條件下,滅菌20min;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮10.0g,加蒸餾水8mL,在121℃、0.1MPa下,滅菌20min。吸取10mL無菌水加入菌種斜面三角瓶中,用接種環(huán)將三角瓶內(nèi)斜面上的孢子輕輕刮下,倒入帶有4層擦鏡紙(滅菌)的無菌漏斗過濾,將過濾后的菌液注入到無菌并盛有小玻璃珠的50mL三角瓶中,同樣方法重復(fù)3次,將剩余的孢子全部沖洗干凈,28℃、200r/min,振蕩30min,使孢子充分分散,要求孢子分散率超過90.0%,得到單孢子懸液。將菌懸液以2.0%(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(100/250mL),28℃、pH7.0、培養(yǎng)72h,以中性蛋白酶活力作為評價指標(biāo)。1.3.2米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素實驗:分別考察碳源種類及其添加量、氮源種類及其添加量和無機鹽對產(chǎn)中性蛋白酶的影響;正交實驗:在單因素實驗基礎(chǔ)上,確定碳源、氮源、無機鹽這3個因素對米曲霉菌株產(chǎn)蛋白酶活力具有顯著性影響(P<0.05),選取L9(34)正交表分別進行進一步的優(yōu)化實驗,以中性蛋白酶活力為評價指標(biāo),進行米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基組分的優(yōu)化。1.3.3米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化利用優(yōu)化的培養(yǎng)基,采用單因素對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,分別考察時間、溫度、初始pH、加水量對產(chǎn)中性蛋白酶的影響。1.3.4中性蛋白酶活力測定按照國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T23527—2009),采用Folin-酚法測定中性蛋白酶活力。2結(jié)果與分析2.1不同碳源的菌株對酶活的影響由圖1可知,實驗選取的幾種碳源,均能夠被米曲霉利用產(chǎn)生蛋白酶。對于菌株40214在葡萄糖(P<0.05)作為碳源時所產(chǎn)酶活最大,為1920.59U/mL,淀粉次之,菌種對這2種碳源利用效果較好,這可能與菌體蛋白酶系的合成有關(guān)。而以蔗糖作為碳源時,菌株酶活最低為1800.55U/mL。結(jié)果可能說明單糖比二糖更能促進菌體產(chǎn)酶,因而選擇葡萄糖作為碳源。2.2不同氮源對酵母粉產(chǎn)酶的影響在微生物的代謝過程中,氮源主要被轉(zhuǎn)化為核酸、氨基酸以及構(gòu)成細(xì)胞壁的成分,并且是微生物生長的主要營養(yǎng)。由圖2可知,選取的幾種氮源,在相同培養(yǎng)時間,產(chǎn)酶能力有所不同,酵母粉(P<0.05)作為氮源時,菌株40214產(chǎn)酶活力最佳,為2057.25U/mL。當(dāng)選用大豆粉作氮源時,菌株產(chǎn)酶能力只是略低于酵母粉,為2023.95U/mL,考慮到實際的生產(chǎn)情況,選擇大豆粉作為氮源更能節(jié)約成本,并且達(dá)到良好的產(chǎn)酶效果。2.3不同碳源對重組菌芽孢桿菌酶活力的影響碳源是霉菌發(fā)酵中所需最大的營養(yǎng)物質(zhì),碳源添加量直接影響菌種的產(chǎn)酶情況。由圖3可以看出,當(dāng)葡萄糖添加量為2.0%~8.0%時,菌株40214的蛋白酶活顯著上升(P<0.05),達(dá)到8.0%時對碳源的利用效果最好,產(chǎn)生的酶活最高,達(dá)到2097.30U/mL,隨著碳源濃度的繼續(xù)增加,可看出酶活力有較顯著下降,可知高濃度的葡萄糖比低濃度葡萄糖對產(chǎn)酶有較高的影響。2.4酵母粉添加量對酵母粉產(chǎn)酶的影響酶本身是蛋白質(zhì),而氮元素是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要元素,因此氮源添加量對于產(chǎn)酶有重要作用。實驗測定了不同添加量的酵母粉對菌株產(chǎn)酶的影響,由圖4可以看出,當(dāng)酵母粉添加量為2.0%~4.0%時,菌株40214的蛋白酶活顯著上升(P<0.05),當(dāng)酵母粉添加量為4.0%時,菌株對氮源的利用效果達(dá)到最好,達(dá)到2199.00U/mL。而當(dāng)酵母粉添加量高于4.0%時,由于濃度增加,會導(dǎo)致溶液變得粘稠,使底物流動性下降,不利于菌種生長及產(chǎn)酶。2.5na+對重組菌膜通過性的影響由圖5可以看出,Na2HPO4和KNO3(P<0.05)對菌株40214產(chǎn)酶均有促進作用,Na2HPO4的促進作用更明顯,能夠使酶活達(dá)到2234.01U/mL,由于Na+能使細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓改變,膜通透能力增加,而微生物原蛋白水解酶均為胞外酶,膜內(nèi)外滲透壓的改變有利于酶從膜內(nèi)往外運輸,并且Na+可能對目的菌株具有一定的激活作用,因而產(chǎn)酶效果較好。而添加的FeSO4和MgSO4對產(chǎn)酶均有不同程度的抑制作用,而FeSO4的抑制效果最明顯,可能是由于FeSO4破壞了酶的次級鍵,改變了酶的三維結(jié)構(gòu),即變性作用,這種原因引起的酶活性降低或喪失叫做鈍化作用。2.6最優(yōu)產(chǎn)酶條件的確定在單因素實驗基礎(chǔ)上,米曲霉40214選取對中性蛋白酶活力影響顯著(P<0.05)的葡萄糖、酵母粉、Na2HPO4為考察對象,選用L9(34)分別進行正交實驗,采用SPSS17.0進行分析,結(jié)果見表1、2。米曲霉40214正交實驗極差分析結(jié)果由表1可知,對蛋白酶活力影響大小為:Na2HPO4>葡萄糖>酵母粉,優(yōu)化的最優(yōu)產(chǎn)酶條件為A2B2C1,即葡萄糖8.0%、酵母粉4.0%、Na2HPO40.05%,與正交表中方案5符合,為2227.35U/mL;由于Na2HPO4影響顯著,當(dāng)選擇實驗條件為A2B2C2,即葡萄糖8.0%、酵母粉4.0%、Na2HPO40.10%,在此條件下測得蛋白酶活力為2233.57U/mL,因此選取A2B2C2為最優(yōu)結(jié)果。2.7發(fā)酵溫度對菌株生長和代謝的影響由圖6可知,發(fā)酵溫度在24~28℃時,菌株產(chǎn)酶活力呈逐步升高的趨勢(P<0.05),而當(dāng)培養(yǎng)溫度在28~40℃范圍產(chǎn)酶活力下降,由于超過某一值時,會導(dǎo)致部分酶變性失活,化學(xué)反應(yīng)速率和代謝減弱,代謝產(chǎn)物減少,最初大量繁殖的細(xì)菌會分解代謝產(chǎn)生熱量,使底物濃度更高,促進細(xì)菌衰老。菌株均在28℃時達(dá)到最適溫度,此時40214菌株達(dá)到2220.68U/mL。溫度不僅影響各種酶的反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)性質(zhì),還會影響發(fā)酵液的物理性質(zhì)。溫度升高使反應(yīng)速率和生長代謝加快,提高微生物代謝物產(chǎn)量,但會導(dǎo)致菌體的衰老,并縮短了發(fā)酵周期,使產(chǎn)酶量減少。2.8芽孢桿菌蛋白酶活力變化發(fā)酵時間影響菌體生長情況和蛋白酶產(chǎn)量。由圖7可知,在發(fā)酵48h內(nèi),發(fā)酵液中產(chǎn)酶量很低,培養(yǎng)時間在48~96h時,菌株蛋白酶活力在逐漸上升(P<0.05),而當(dāng)培養(yǎng)時間在96h時,蛋白酶的活力達(dá)到最大值。在之后延長培養(yǎng)時間,蛋白酶活力有明顯的(P<0.05)下降趨勢,因在發(fā)酵后階段,底物不斷消耗的同時,微生物也在逐漸衰亡,導(dǎo)致產(chǎn)酶下降,也可能是因為菌體死亡導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象導(dǎo)致的。所以培養(yǎng)時間均確定為96h,此時40214菌株達(dá)到2695.82U/mL。2.9生化培養(yǎng)基ph對酵母粉菌株產(chǎn)酶的影響由于發(fā)酵過程中的pH很難準(zhǔn)確控制,所以選擇控制發(fā)酵液的初始pH。由圖8可知,菌株的初始pH在pH5.5~6.5范圍內(nèi)產(chǎn)酶效果較好(P<0.05),pH為6.5時,菌種40214酶活最高,為2735.83U/mL。說明中性培養(yǎng)基有利于菌株產(chǎn)酶;堿性培養(yǎng)基不利于菌株產(chǎn)酶。pH通過影響菌體營養(yǎng)物質(zhì)離子化程度、細(xì)胞膜電荷及膜滲透性,從而影響菌體對養(yǎng)分的吸收。對于大多數(shù)菌種來說,一般具有保持其體內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)酸度在近中性條件下的能力,利于新陳代謝和各種酶反應(yīng),但底物的pH對細(xì)胞的新陳代謝和產(chǎn)酶有間接的影響,在不同的初始pH下菌種的生長繁殖能力和產(chǎn)中性蛋白酶的能力存在一定的差異。2.10基質(zhì)加水量對蛋白酶活力的影響由圖9可以看出,加水量在50.0%~60.0%時,隨著培養(yǎng)基加水量的增加,菌株40214的蛋白酶活力顯著增加(P<0.05),當(dāng)加水量為60.0%時蛋白酶活力達(dá)到最大值,為2845.68U/mL,比50%時的2312.34U/mL提高了1.23%,此后再提高加水量則不利于蛋白酶的產(chǎn)生。這是因為基質(zhì)加水量過高,基質(zhì)容易粘結(jié)成團,多孔性降低,不利于菌體獲得營養(yǎng),也影響氧氣的傳遞;反之加水量過低,則使基質(zhì)膨脹程度降低,水的活度低,抑制菌體生長。適宜的加水量有利于米曲霉生長繁殖及孢子的形成,從而影響中性蛋白酶的活性。3表面活性劑用量對米曲霉酶產(chǎn)酶的影響米曲霉產(chǎn)蛋白酶的活力除了對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,還能夠通過其他方式進行提高。首先,實驗中選擇無機鹽Na2HPO4,對米曲霉40214產(chǎn)中性蛋白酶具有促進作用,但對其添加量并沒有進行單因素實驗,所以最終選擇的0.10%是相對最佳值,還可進一步提高;其次,一些表面活性劑也可能會促進產(chǎn)酶;第三,米曲霉菌株對紫外線敏感,可利用紫外誘變進行菌種選育,能夠進一步提高其酶的產(chǎn)量。米曲霉能夠分泌多種酶,如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等,產(chǎn)生酶系與數(shù)量密切相關(guān),因此實驗菌株要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn),應(yīng)對其產(chǎn)生的多種酶進行系統(tǒng)的檢測,明確相互之間的影響,并對生產(chǎn)成本與產(chǎn)品品質(zhì)進行辨證考慮,才能最終確定最