第一章 寄生蟲抗原

第一章寄生蟲抗原及其應(yīng)用在寄生蟲與宿主的相互關(guān)系中，寄生蟲抗原引起宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，特別是那些存在于寄生蟲體表或分泌排泄物內(nèi)的抗原，與宿主的免疫細(xì)胞直接接觸，具有重要的免疫原性。寄生蟲抗原的化學(xué)構(gòu)成：多肽蛋白質(zhì)糖蛋白脂蛋白多糖核酸科技的發(fā)展與寄生蟲抗原的應(yīng)用生物化學(xué)的發(fā)展使得寄生蟲抗原分離純化技術(shù)得到長足的發(fā)展；分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用使得寄生蟲抗原成為診斷方法物質(zhì)基礎(chǔ)和疫苗的可能性成為現(xiàn)實(shí)。第一節(jié)寄生蟲抗原的分類寄生蟲抗原的分類1982年國際寄生蟲學(xué)大會(huì)，Anderson等提出將寄生蟲抗原按以下三個(gè)方面進(jìn)行分類，并得到大會(huì)通過。按照免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類按照寄生蟲學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類按照生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類一、按照免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類1.功能性抗原（1）宿主保護(hù)性抗原與誘發(fā)和表現(xiàn)宿主保護(hù)性免疫有關(guān)的抗原。（2）免疫診斷抗原與建立相關(guān)寄生蟲感染的免疫診斷方法有關(guān)的抗原，如循環(huán)抗原等。（3）免疫病理抗原與誘發(fā)和表現(xiàn)寄生蟲保護(hù)性免疫反映有關(guān)的抗原。（4）寄生蟲保護(hù)性抗原與誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)但同時(shí)能夠?qū)纳x產(chǎn)生實(shí)際具有保護(hù)性質(zhì)的抗原。2.按照在不同宿主的免疫原性進(jìn)行分類（1）自然抗原使宿主在自然感染的情況下或者對(duì)自然宿主進(jìn)行免疫接種時(shí)使宿主機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗原。（2）新抗原又稱為異源抗原，非自然宿主的免疫接種和非相容性宿主的免疫接種用抗原。3.半抗原在一定環(huán)境條件下寄生蟲產(chǎn)生的載體決定簇，主要引起細(xì)胞免疫的非正?；顒?dòng)。如：刺激T淋巴細(xì)胞的載體決定簇，刺激B淋巴細(xì)胞的半抗原決定簇，刺激抑制性T淋巴細(xì)胞的決定簇。二、按寄生蟲學(xué)標(biāo)準(zhǔn)分類1.來源和定位（1）可溶性外抗原從活的寄生蟲、被寄生的細(xì)胞或培養(yǎng)的寄生蟲釋放的抗原。（2）可溶性體抗原自寄生蟲或被寄生蟲寄生的細(xì)胞浸出的表面或內(nèi)部抗原。成蟲浸出液幼蟲體抗原感染細(xì)胞表面抗原（3）蟲體抗原死寄生蟲寄生蟲碎片寄生蟲分泌泡生活的全蟲寄生蟲體腔液寄生蟲特殊器官分泌液體絳蟲幼蟲的囊液等。2.按照蟲群的生活史分類（1）蟲特異性抗原屬特異性抗原種特異性抗原株特異性抗原期特異性抗原蛻皮抗原三、按生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類1.按照組成成分蛋白質(zhì)脂肪糖類核酸2.按照特性分類大小鏈結(jié)構(gòu)決定簇?cái)?shù)目類型3.按照分子功能分類酶代謝物受體識(shí)別結(jié)構(gòu)4.未來抗原的來源在各種媒介體內(nèi)克隆的DNA的表達(dá)化學(xué)合成抗-獨(dú)特型抗體抗原第二節(jié)寄生蟲抗原的分離、純化和鑒定寄生蟲抗原的分離、純化和鑒定是研究寄生蟲免疫機(jī)理和免疫病理、研究寄生蟲快速免疫診斷方法和疫苗的基礎(chǔ)。一、寄生蟲抗原的分離1.蟲體抗原收集蟲體，洗凈表面粘附物，在磷酸緩沖液中之稱勻漿，離心后的上清即為可溶性蟲體抗原。球蟲2.ES抗原排泄分泌抗原由培養(yǎng)寄生蟲的培養(yǎng)液中經(jīng)過濃縮、層析分級(jí)獲得?？捎糜诿庖咴\斷。3.膜抗原主要成分是膜蛋白，分為膜表面蛋白和膜組成蛋白。膜表面蛋白通過用金屬螯合物或高離子強(qiáng)度的緩沖液溶解，然后通過分級(jí)處理獲得。膜組成蛋白可以用清潔劑、有機(jī)溶劑溶解并分級(jí)處理獲得。二、純化通過物理的、化學(xué)的方法，利用寄生蟲抗原的物理化學(xué)特性進(jìn)行組分分離的過程稱為寄生蟲抗原的純化。常用有以下3類方法1.凝膠層析凝膠層析是一種以分子大小為基礎(chǔ)的分離技術(shù)，凝膠中每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)的小孔使被分離組分在流經(jīng)途徑上出現(xiàn)差別，大分子物質(zhì)首先從孔外經(jīng)過，首先被洗脫出來，其次是較小的組分，最后是小分子物質(zhì)。常用的載體：交聯(lián)葡聚糖如：Sephadex瑞典瓊脂糖凝膠如：sepharoase瑞典bio-gel-A美國super-Ago-Gel美國聚丙烯酰胺凝膠如：bio-GelP美國2.離子交換層析離子交換層析是用離子交換劑（具有離子交換性能的物質(zhì)）作固定相，利用它與流動(dòng)相中的離子能進(jìn)行可逆的交換性質(zhì)來分離離子型化合物的層析方法。?

即溶液中的離子同離子交換劑上功能基團(tuán)交換反應(yīng)的過程。。原理：依靠靜電吸引溶液中帶相反電荷的離子結(jié)合，利用待分離的各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)或所帶電荷的不同而引起的與載體結(jié)合力不同和進(jìn)行區(qū)分。分類：陰離子交換劑陽離子交換劑陰離子交換劑纖維載體上結(jié)合陽離子基團(tuán)如：DEAE纖維素DEAEsephadexQAE-sephadex陽離子交換劑離子交換劑上面帶有陰離子如：CM-纖維素CM-sephadex注意點(diǎn)：要將樣品中各組分分別洗脫，必須改變洗脫液的離子強(qiáng)度和PH，以提高解脫吸附的能力。帶電荷量少，親和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親和力大的后被洗脫下來。離子交換過程示意：起始吸附解吸完成x+:起始緩沖離子

y+：待分離離子

z+：待分離離子考慮因素：1.被分離物質(zhì)帶何種電荷2.被分離物質(zhì)分子的大小大分子物質(zhì)選用凝膠，其次選用纖維素3.被分離物質(zhì)所處的環(huán)境4.被分離物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)5.被分離物質(zhì)的大概數(shù)量根據(jù)分離過程的實(shí)驗(yàn)條件強(qiáng)酸強(qiáng)堿—應(yīng)用廣泛弱酸型—只能在堿性pH范圍內(nèi)使用弱堿型—只能在酸性pH范圍內(nèi)使用緩沖液的選擇原則：不能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，所帶電荷應(yīng)與樣品一致。避免使樣品變性洗脫劑

原則：所用洗脫液比吸著物質(zhì)具有更活潑的離子或基團(tuán)改變pH或離子強(qiáng)度

增強(qiáng)洗脫液與離子交換劑的結(jié)合力

降低分離物與離子交換劑的結(jié)合力洗脫方式：梯度洗脫每收集管中加入2ml茚三酮顯色液，充分混合，沸水浴15分鐘，自來水冷卻，觀察氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)，若生成紫色化合物，則說明收集到氨基酸。3、親和層析親和層析(affinitychromatography)

將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析。

在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)分離純化方法。

原理

親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。載體的基本要求和選擇

理想的載體應(yīng)具有下列基本條件：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質(zhì)，非特異性吸附少；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；④理化性質(zhì)穩(wěn)定；⑤機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙烯酰胺凝膠是目前的首選優(yōu)良載體。

瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細(xì)菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，如0.1Mol/LNaOH或1Mol/LHCl處理2h~3h及蛋白質(zhì)變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質(zhì)改變，故易于再生和反復(fù)使用。

瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用最廣。圖示基本過程：

固相化

(Immobilise)

配基Ligand:親和層析中能被某一生物大分子識(shí)別和可逆結(jié)合的生物專一性物質(zhì)。

基質(zhì)Matrix(載體):親和層析中與配基共價(jià)結(jié)合,使其固相化的物質(zhì)。吸附

(Adsorption)解吸(Elution)三.鑒定1.抗原組分及化學(xué)性質(zhì)（1）SDS十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS由一個(gè)非極性的疏水區(qū)和一個(gè)強(qiáng)陰離子基團(tuán)組成，在有SDS和還原劑存在的情況下低聚物的蛋白質(zhì)解離成多肽鏈，各種大小的蛋白質(zhì)在凝膠中形狀相同，所以可以根據(jù)電泳的速度來判斷分子量的大小。（2）雙向電泳第一向電泳：等點(diǎn)聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離第二向電泳SDS電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小進(jìn)行分離電源等電聚焦儀（第一向）恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）（3）氨基酸序列測(cè)定最終目的是為了合成蛋白或者是多肽，諾氏瘧原蟲CSP，環(huán)子孢子蛋白質(zhì)，12個(gè)氨基酸殘基組成的重復(fù)結(jié)構(gòu)。2.抗原活性極其特異性鑒定（1）血清學(xué)方法（2）體外實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（3）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過敏性反應(yīng)T淋巴細(xì)胞與有絲分裂原在體外共同培養(yǎng)時(shí)，受到后者的刺激可發(fā)生形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的變化，部分小淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不成熟的母細(xì)胞，并進(jìn)行有絲分裂，這種方法稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(lymphocytetransformationtest)。T淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)植物血凝素激活后，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，根據(jù)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況，可反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低表示細(xì)胞免疫水平低下?？崭钩槿§o脈血3ml，加人25ul肝素抗