第六章-分子生物學(xué)研究方法(上)基因工程技

第六章分子生物學(xué)研究方法（上）

——基因工程基因工程（gengticengineering）是分子生物技術(shù)中最主要的研究?jī)?nèi)容之一，又稱為DNA重組技術(shù)（recombinantDNAtechnique）或分子克隆。它涉及到特地基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)技術(shù)。

第一節(jié)概述一、基因工程(geneticengineering)的概念：基因工程又稱為基因克隆、DNA重組、DNA克隆、分子克隆,即應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增，提取獲得大量同一DNA分子拷貝或其表達(dá)產(chǎn)物的過(guò)程?？寺。╟lone）無(wú)性繁殖基因克隆（genecloning）或分子克隆,又稱為重組ＤＮＡ技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過(guò)程。克?。╟lone）:指含有單一的DNA重組體的無(wú)性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系的過(guò)程(cloning)。二、基因工程技術(shù)的基本原理和步驟

一個(gè)完整的體外DNA重組技術(shù)主要包括以下步驟：1獲取目的基因；2、將目的基因進(jìn)行必要的改造；3、選擇和修飾克隆載體；4、將目的基因與載體連接獲得含有目的基因的重組載體；5、重組載體導(dǎo)入相應(yīng)細(xì)胞（稱為宿主細(xì)胞）；6、篩選出含重組DNA的細(xì)胞等等；基因克隆示意圖三、基因工程技術(shù)的目的

基因工程技術(shù)的目的主要有兩個(gè)方面：一是獲得足夠的DNA片段以分析基因的結(jié)構(gòu)；二是將獲得的基因用于發(fā)展農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)。四、基因工程技術(shù)的意義基因工程技術(shù)的意義是：鑒于重組基因工程具有外源性的核酸分子在另一種不同宿主生物細(xì)胞內(nèi)所進(jìn)行的繁殖和特定的DNA片段在新宿主內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增的兩大特點(diǎn)，所以達(dá)到種屬內(nèi)外重組（遺傳信息的交換轉(zhuǎn)移），從而使得很多從自然界難以獲得或不能獲得的蛋白質(zhì)得到大量的制備，人類能以更快速度或更準(zhǔn)確目標(biāo)進(jìn)行生物品種改良，甚至創(chuàng)造新物種。它為人類改造生命和創(chuàng)造新生命起到難以估量的作用。五、基因工程大事記1973Cohen完成第一例細(xì)菌基因克隆實(shí)驗(yàn)。1978Genentech公司首次在大腸桿菌中產(chǎn)生由人工合成基因表達(dá)的人胰島素。世界上第一種基因工程蛋白藥物；1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用；

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚。

1993基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997英國(guó)羅斯林研究所多莉羊1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃.負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息生物技術(shù)工程：基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程目前，市場(chǎng)上的基因工程產(chǎn)品有胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子Ⅷ脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組基因重組(geneticrecombination)——整段DNA在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間,甚至不同物種間進(jìn)行交換,并能在新的位置上復(fù)制,轉(zhuǎn)錄和翻譯自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無(wú)目的基因工程有目的第二節(jié)基因工程工具酶基因的分離、重組、構(gòu)建是由一系列酶促反應(yīng)所完成的。在基因工程技術(shù)中，要利用各種不同的工具酶來(lái)對(duì)基因進(jìn)行相應(yīng)的加工處理。常用的工具酶包括以下幾類：基因工程常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶切割DNADNA連接酶生成3′-5′磷酸二酯鍵DNA聚合酶Ⅰ探針標(biāo)記、補(bǔ)平3′末端反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶3′末端多聚尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme，RE)1、限制性核酸內(nèi)切酶概念：限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases，RE）亦稱為限制性內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱限制酶或內(nèi)切酶，是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列且能產(chǎn)生具有二重對(duì)稱特異序列（回文序列，pelindromicsequence）結(jié)構(gòu)的DNA水解酶，也是原核生物所特有的酶。限制性核酸內(nèi)切酶

restrictionendonuclease一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。

識(shí)別特異核苷酸序列：大多為4-6bp的回文對(duì)稱（palindromesequence）5’GAATTC3’5’GGATCC3’

3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’（二）限制性核酸內(nèi)切酶分布：限制性核酸內(nèi)切酶的分布很廣，多數(shù)來(lái)自細(xì)菌，有的來(lái)自藍(lán)藻和鏈酶菌，極少數(shù)存在于支原體等微生物在中。3、限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)在識(shí)別和切割序列方面的特性、催化條件和修飾活性等，一般可分為三型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，Ⅰ型和Ⅲ型有內(nèi)切和修飾雙重作用，但切割位點(diǎn)無(wú)特異性；Ⅱ型只具有切割作用，無(wú)修飾作用，且對(duì)切割位點(diǎn)具有很強(qiáng)的特異性。只有Ⅱ型在分子生物學(xué)中被應(yīng)用。三類限制性核酸內(nèi)切酶性質(zhì)比較性質(zhì)第一類第二類第三類限制-修飾活性多功能酶限制酶與修飾酶分開多功能酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三種不同亞基相同亞基二種不同亞基輔助因子Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、ATP、SAM*分子量大小大切割位點(diǎn)非特定，離識(shí)別位點(diǎn)1Kb特定，在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)特定，離識(shí)別位點(diǎn)24-26處4、限制性核酸內(nèi)切酶命名Smith和Nathame命名原則（1973）

屬名+種名+株名+流水號(hào)

舉例：流感噬血桿菌d株

（Haemophilusinfluengaed）

HindⅠ

HindⅡ

HindⅢ5’AAGCTT3’

HindⅣ3’TTCGAA5’

5、限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn):

(1)識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列呈二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱（即具有迥文結(jié)構(gòu)）；(2)切割DNA均產(chǎn)生含5’-磷酸和3’-羥基的末端；(3)錯(cuò)位切割產(chǎn)生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿對(duì)稱軸切割雙鏈DNA產(chǎn)生平頭末端，也稱鈍性末端。(4)少數(shù)不同的限制酶可識(shí)別和切割相同的位點(diǎn)，這些酶稱為同切酶，如MboIⅠ和Sau3A。同工異源酶：來(lái)源不同，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶。同尾酶：識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端的酶。RE切割出現(xiàn)兩種末端粘性末端，又稱為粘端，是指雙鏈DNA分子在RE作用下，形成具有互補(bǔ)堿基的單鏈突出末端。平頭末端平端

粘性末端與平頭末端6、限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用1、DNA重組：2、構(gòu)建新質(zhì)粒；3、組建DNA物理圖譜；4、DNA分子雜交；5、制備DNA放射性探針：使用限制性核酸內(nèi)切酶，將標(biāo)記大片斷切割成小片斷，作放射性探針。6、DNA序列分析：利用限制性核酸內(nèi)切酶切割大片斷成小片斷，便于序列分析。二、DNA聚合酶1、DNA聚合酶的概念DNA聚合酶（DNApolymerase）是催化以DNA或RNA為模板合成DNA的酶，在DNA重組技術(shù)中用于DNA的體外合成。2、基因工程中常用的DNA聚合酶

（一）Klenow片段：又名DNA聚合酶Ⅰ大片段，是由大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生出來(lái)的大片段分子。（1）活性：Klenow聚合酶仍具有5，→3，聚合酶活性和3，→5，外切酶活性，但是失去了5，→3，外切酶活性。是基因工程常用的工具酶。（2）用途：①cDNA第二鏈的合成；

②對(duì)DNA分子3′突出端進(jìn)行末端標(biāo)記。（二）大腸桿菌DNA聚合酶(polⅠ)（1）活性：具有5′至3′的聚合活性;5′→3′方向和核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性；（2）用途：①制備DNA探針；

②填充dsDNA小裂口，有利于體外重組；③對(duì)DNA分子3′突出端進(jìn)行末端標(biāo)記。核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性3、TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶來(lái)自極度嗜熱的棲熱水生菌（ThermusaquaticusTaq），該酶耐熱，最佳反應(yīng)溫度為700C左右，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶。（1）活性：具有5′→3′的聚合活性和5′→3′核酸外切酶活性，不具有3′→5′外切酶活性。（2）用途：主要用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreactionPCR）。①以mRNA為模板合成cDNA第一鏈；

②以單鏈DNA或RNA為模板，制備雜交用探針。4、逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)

（1）反轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）的概念：亦稱為逆轉(zhuǎn)錄酶或RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶，是以RNA為模板合成DNA的酶。目前已經(jīng)從許多種RNA腫瘤病毒中分離到這種酶，但最普遍使用的則是來(lái)源于禽類髓細(xì)胞增生病毒（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）（avianmyeloblastosisvirusAMV）的反轉(zhuǎn)錄酶。（2）活性：具有5′→3′的聚合活性和5′→3′核酸外切酶活性，但不具有3′→5′外切酶活性；同時(shí)具有RNaseH活性，具有5′→3′和3′→5′方向特異地降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈的作用。（2）用途：①DNA的序列分析；

②用于各種PCR。三、DNA連接酶在基因工程技術(shù)中最常用的是T4DNA連接酶，其次是大腸桿菌DNA連接酶。1、大腸桿菌DNA連接酶：需要NAD做能源；只能連接粘性末端，不能連平頭末端。（1）活性：具有催化3′→5′磷酸二酯鍵形成的活性；（2）用途：①粘端DNA或DNA切口間的連接；該酶連接粘性末端的溫度一般為4-15℃，連接切口的溫度為37℃。

2、T4DNA連接酶：是最早從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)并提取的DNA連接酶。該酶的催化活性需要ATP做能源、Mg2+作輔助因子；（1）活性：可催化雙鏈DNA片段5′-P和3′-OH間形成磷酸二酯鍵，進(jìn)而將兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)片段。既是將目的DNA與載體DNA連接起來(lái)的工具酶。（2）用途：即可用于粘性末端的連接，也可用于平齊末端的連接。該酶在低濃度時(shí)（0.1U濃度）連接粘性末端，在高濃度（1-2U）時(shí)連接平齊末端。對(duì)平齊末端的連接效率低得多。四、DNA修飾酶1、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase)基因工程中常用的有牛小腸堿性磷酸酶（CIP）和細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）。（1）活性：具有水解DNA或RNA5′磷酸酯鍵的活性，使5′-P成為5′-OH。

（2）用途：①去除DNA片段的5′磷酸，防止載體DNA的自身環(huán)化；2、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal）

（1）活性：具有5′→3′聚合作用，但其聚合作用不需要模板。（2）用途：①給載體或cDNA3′-OH末端加上互補(bǔ)的同聚物尾巴；②用于寡核苷酸探針的末端標(biāo)記。末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶(TDT)3、核酸酶

（1）外切核酸酶Ⅲ（RNaseⅢ）它來(lái)源于大腸桿菌。（1）活性：具有水解3′→5′磷酸二酯鍵的作用，按3′→5′方向降解雙鏈DNA，釋放5′-P單核苷酸。此外還具有RNaseH活性。（2）用途：制備片段特異性探針和線型DNA。（2）DNaseⅠ脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease，亦稱DNaseⅠ），該酶屬于脫氧核糖核酸內(nèi)切酶，是從牛胰中分離得到的。（1）活性：在dsDNA或ssDNA鏈內(nèi)部隨機(jī)水解3′→5′磷酸二酯鍵；產(chǎn)物為5′磷酸末端的單核苷酸或寡核苷酸。（2）用途：①主要用于切口平移時(shí)制備放射性探針。（3）RNaseA該酶屬于核糖核酸內(nèi)切酶，來(lái)源于牛胰。（1）活性：在RNA鏈內(nèi)部專一性水解嘧啶殘基的3′末端，；水解與其相鄰的核苷酸之間所形成的3′→5′磷酸二酯鍵，產(chǎn)物為嘧啶3′磷酸及末端帶有嘧啶的3′磷酸寡核苷酸。（2）用途：①?gòu)腄NA：RNA雜交體中除去尚未雜交的RNA區(qū)。第三節(jié)基因工程載體（vector）一、載體的概念：載體是指能夠?qū)⑼庠葱訢NA（目的DNA）片段引入宿主細(xì)胞并能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制或最終使外源性DNA表達(dá)的自主DNA。二、載體的類型一種載體中的不同元件，如復(fù)制區(qū)、啟動(dòng)子和抗性基因等可以分別取自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體DNA或病毒DNA等。按照基本元件組成的不同來(lái)源，可以將載體分為質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒和人工染色體等類型。

三、理想載體應(yīng)該具備的條件：1、在宿主細(xì)胞中具有自我復(fù)制能力，或能夠整合到宿主染色體上與基因組一同表達(dá)。2、拷貝數(shù)多;3、應(yīng)具有篩選標(biāo)志；如有兩三個(gè)遺傳標(biāo)志，如抗藥性基因：抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)4、必須有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)，即RE切割位點(diǎn)，多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。5、分子量不宜過(guò)大，以利于體外操作；6、最好配備有調(diào)控元件，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等；7、載體DNA與宿主DNA容易分開，便于提純。宿主細(xì)胞是基因克隆中重組DNA分子的繁殖場(chǎng)所，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，必須符以下條件：１、

對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制；２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA；３、在重組DNA增殖過(guò)程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾；４、

重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組；５、

容易導(dǎo)入重組DNA分子；６、

符合重組DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。四、常用的克隆載體（一）質(zhì)粒(plasmid)載體：1、質(zhì)粒(plasmid)的概念：質(zhì)粒是存在于大多數(shù)細(xì)菌和某些真核生物細(xì)胞染色體外的具有自主復(fù)制的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。任何染色體外自體復(fù)制的遺傳單位，稱為質(zhì)粒。質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小的閉環(huán)雙鏈DNA分子，能自主復(fù)制，并在細(xì)胞分裂時(shí)遺傳給子代細(xì)胞。因?yàn)橘|(zhì)粒是一個(gè)完整的獨(dú)立復(fù)制子，并能轉(zhuǎn)化細(xì)胞，即將它的一個(gè)復(fù)本從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移給受體細(xì)胞，而且能給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶來(lái)遺傳標(biāo)記，故在基因工程中作為載體被廣泛使用。質(zhì)?？少x予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀如抗藥性等，通過(guò)質(zhì)粒賦予細(xì)菌的表型可識(shí)別質(zhì)粒的存在，這是篩選重組轉(zhuǎn)化子的基礎(chǔ)。作為載體的質(zhì)粒一般具有以下特點(diǎn)：（1）

分子相對(duì)較?。ǎ?１０kb）；（2）

松馳型復(fù)制；（3）具有適當(dāng)?shù)亩嗫寺∥稽c(diǎn)以便外源DNA插入；（4）具有插入失活篩選標(biāo)志，便于從平板上直接篩選陽(yáng)性重組子；（5）質(zhì)粒能攜帶的外源DNA片段一般較?。?lt;15kb）。2、質(zhì)粒(plasmid)的復(fù)制類型質(zhì)粒可在細(xì)菌中不斷地復(fù)制自身，一個(gè)細(xì)菌中有許多質(zhì)粒分子，稱為拷貝數(shù)。質(zhì)粒拷貝數(shù)：是指每條細(xì)菌染色體所平均具有的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目。根據(jù)宿主細(xì)胞所含的拷貝數(shù)，可以把質(zhì)粒分為兩種不同的復(fù)制類型：（1）嚴(yán)緊型質(zhì)粒：它的復(fù)制依賴于細(xì)菌合成的復(fù)制啟動(dòng)蛋白，即受到宿主細(xì)胞的嚴(yán)格控制，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（復(fù)制啟動(dòng)蛋白）合成終止，質(zhì)粒與染色體復(fù)制亦停止，或細(xì)菌停止繁殖，質(zhì)粒復(fù)制也停止，故宿主細(xì)胞中只含1-3個(gè)拷貝。（2）松弛型質(zhì)粒：它的復(fù)制不依賴于細(xì)菌合成的復(fù)制啟動(dòng)蛋白，而是由自身編碼的起始蛋白控制。因此，這種質(zhì)粒能自身有節(jié)律地復(fù)制自己，細(xì)菌停止繁殖時(shí)，自身還能復(fù)制擴(kuò)增。故每個(gè)宿主細(xì)胞中能達(dá)10-200個(gè)拷貝。如采用蛋白質(zhì)合成抑制劑（如氯霉素）抑制宿主細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制，拷貝數(shù)可達(dá)到3000個(gè)，即為質(zhì)粒擴(kuò)增?；蚬こ讨兴玫馁|(zhì)粒載體為松弛型上所建立的改造型。3、常用的克隆質(zhì)粒載體用于基因工程中的質(zhì)粒絕大多數(shù)為人工改建的。凡經(jīng)過(guò)改建而適于作為基因克隆的所有質(zhì)粒DNA載體具有以下共性：（1）有一定大小的復(fù)制子；（2）有抗性篩選標(biāo)志；如抗氨芐青霉素基因(ampr)

、抗四環(huán)素基因(terr)；（3）有多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsites,MCS)，即RE切割位點(diǎn)，多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。（4）分子量小而拷貝數(shù)多；（1）pBR322—復(fù)制型載體它是人工構(gòu)建的重要質(zhì)粒。由三個(gè)不同來(lái)源親本質(zhì)粒經(jīng)復(fù)雜重組過(guò)程構(gòu)建而來(lái)。第一部分：來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（Terr）；第二部分：來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3氨卞青霉素的抗性基因（Ampr）；第三部分：來(lái)源于ColE派生的質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制點(diǎn)。pBR322是經(jīng)典環(huán)狀雙鏈DNA質(zhì)粒載體的代表，長(zhǎng)4.36kb。含四環(huán)素和氨芐青霉素兩個(gè)抗性基因（AmpR和

TetR）及數(shù)個(gè)單一酶切位點(diǎn)，三個(gè)單一酶切位點(diǎn)BamHⅠ、HindⅢ、SalⅠ均在TetR基因內(nèi)；PstⅠ識(shí)別位點(diǎn)在AmpR基因內(nèi)。當(dāng)外源基因插入這些位點(diǎn)時(shí)，就可以分別成為AmpS敏感和TetS敏感。利用這些遺傳標(biāo)記，可篩選出重組體轉(zhuǎn)化菌。pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：分子量較小，其長(zhǎng)度為4363bp因而易于純化和防止純化過(guò)程中鏈的斷裂；第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有兩種抗生素抗性基因可作為轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)志；（Terr）（Ampr）質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因基因的插入失活效應(yīng)，是檢測(cè)重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。例如：將外源DNA片段克隆在pBR322質(zhì)粒的BamHⅠ或SalⅠ位點(diǎn)，由于阻斷了Terr基因編碼序列的連續(xù)性，使其失活，產(chǎn)生了具有TerSAmpr表型的重組的pBR322質(zhì)粒。將這種重組的pBR322質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型（TerSAmpS）大腸桿菌細(xì)胞中并涂布在含氨卞青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上，那么存活下來(lái)的菌落都將具有Ampr的表型，它們也必定是獲得了編碼有這種抗性基因的轉(zhuǎn)化子。第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：是具有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可達(dá)到1000-3000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。（2）pUC質(zhì)粒載體—表達(dá)型載體pUC質(zhì)粒是在pBR322質(zhì)?；A(chǔ)是改建而成，它含有pBR322質(zhì)粒的大部分，有Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。pUC系列質(zhì)粒載體包括以下四個(gè)部分：第一部分：來(lái)自于pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起始（ori）第二部分：來(lái)自于pBR322質(zhì)粒的氨卞青霉素的抗性基因（Ampr），但它的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的RE位點(diǎn)；第三部分：來(lái)源于大腸桿菌的lacZ基因（包括β–半乳糖苷酶Z基因和控制其表達(dá)的啟動(dòng)子、操縱基因、和調(diào)節(jié)基因）。第四部分：在lacZ基因內(nèi)靠近5′-端有一段來(lái)源于M13的多克隆位點(diǎn)（MCS區(qū)段）。pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)：有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)；第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)：可用組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體，篩選簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間；第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段。可把具有兩種不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。（3）穿梭質(zhì)粒載體

穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可在兩種不同的宿主細(xì)胞中成活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，特別是能在原核生物和真核細(xì)胞之間往返穿梭，因此在基因工程研究中具有廣泛的用途。（二）噬菌體載體（phage）1、噬菌體的概念：噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱。它在大多數(shù)細(xì)菌中存在，能夠自我復(fù)制，但不能在宿主外生長(zhǎng)和復(fù)制。

2、噬菌體類型（1）單鏈DNA噬菌體，如M13和f1噬菌體；（2）雙鏈DNA噬菌體，如λ噬菌體、T1、T3、T4、T5噬菌體；（3）RNA噬菌體，如R17、Qβ噬菌體。噬菌體作為載體一般以λDNA和M13最為常用。2、M13噬菌體M13噬菌體是一種絲狀大腸桿菌病毒，其遺傳物質(zhì)為閉合環(huán)狀，長(zhǎng)度為6.5Kb，以單鏈形式存在于噬菌體顆粒內(nèi)。它的感染型是單鏈DNA，侵犯宿主后，在細(xì)菌體內(nèi)借助宿主的酶系統(tǒng)，先將單鏈DNA復(fù)制為雙鏈DNA，構(gòu)成復(fù)制型雙鏈DNA環(huán)。復(fù)制型在菌體內(nèi)繼續(xù)繁殖，可達(dá)200多個(gè)拷貝。野生型M13DNA無(wú)RE位點(diǎn)，因此常用的是人工構(gòu)建的系列。在M13基因組中含507個(gè)核苷酸的非必需區(qū)，在這個(gè)區(qū)域插入外源DNA不會(huì)影響M13的繁殖和生存，現(xiàn)在使用的M13載體如M13Mp18等均為對(duì)此區(qū)域進(jìn)行改造而獲得。M13克隆的最大問(wèn)題是不能插入較大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13載體的優(yōu)點(diǎn)是從細(xì)菌中釋放出來(lái)的噬菌體顆粒中含有一條與克隆的模板DNA互補(bǔ)的單鏈，所以最適合于制備DNA測(cè)序時(shí)用的單鏈模板，另外也可用于制備單鏈特異性DNA探針。構(gòu)建型M13有Mp系列，其中的代表是的M13mp18和19，它們由以下部分構(gòu)成：（1）來(lái)源于大腸桿菌的lac操縱子控制區(qū)（包括啟動(dòng)子、操縱基因）。（2）含有大腸桿菌的lac操縱子調(diào)控元件（包括β–半乳糖苷酶Z基因和lacI和lacZ基因內(nèi)靠近5′端有一段多克隆位點(diǎn)。目的基因可在多克隆位點(diǎn)上任一酶切位點(diǎn)插入。目的基因插入后，破壞lacZ基因的完整性，使lacZ基因不能表達(dá)，則β–半乳糖苷酶不能合成。因而可用異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和5–溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）作為藍(lán)白斑試驗(yàn)，進(jìn)行陽(yáng)性重組體克隆篩選。用這些重組體載體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補(bǔ)加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上，若為陽(yáng)性重組體克隆，則lacZ基因被破壞，β–半乳糖苷酶不能合成，X-gal不能分解，則形成無(wú)色的噬菌斑；若為陰性克隆，則lacZ基因不被破壞，β–半乳糖苷酶能合成，X-gal被分解，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，則形成藍(lán)色的噬菌斑。

3.λ噬菌體（1）λ噬菌體的概念：λ噬菌體是一種大腸桿菌病毒，為線狀雙鏈DNA分子，其長(zhǎng)度約為48531bp，共有50多個(gè)基因。線性λ噬菌體DNA分子的兩端各有12堿基的互補(bǔ)單鏈序列，是天然的粘性末端。（2）λ噬菌體的基因組：左臂長(zhǎng)約20kb,含噬菌體頭、尾蛋白編碼基因；中央片段長(zhǎng)約12-24kb,對(duì)噬菌體為非必需區(qū)；右臂長(zhǎng)約10kb,含λ噬菌體復(fù)制和溶菌相關(guān)蛋白的編碼基因。所有λ噬菌體載體均為通過(guò)切除非必需的中央?yún)^(qū)，并增減某些限制性酶切位點(diǎn)和插入適當(dāng)?shù)暮Y選標(biāo)記基因改造而成。λ噬菌體基因組有兩個(gè)特點(diǎn)：第一個(gè)特點(diǎn)：功能相關(guān)的基因排列在一起，位于左右臂，此部分是λ噬菌體在大腸桿菌中繁殖、溶菌所必需的；中間區(qū)段不是繁殖、溶菌所必需的可以除去，故該區(qū)段可做為外源DNA片段的插入?yún)^(qū)域；即分三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)、中間區(qū)（非必需區(qū)）、右側(cè)區(qū)。第二個(gè)特點(diǎn)：噬菌體的成熟需要經(jīng)過(guò)包裝，即需要將重組DNA包裝進(jìn)入λ噬菌體的頭部和尾部蛋白中。（3）已構(gòu)建的λ噬菌體載體分為兩類：１、置換型載體：在其中央部分有兩個(gè)酶切位點(diǎn)或兩組排列相反的多克隆位點(diǎn)，其間的DNA片段可被外源DNA置換。這類載體適于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。２、插入型載體：只有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或一組多克隆位點(diǎn)可供外源基因插入。這類載體允許插入5-7kb的外源DNA,適于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。如λgt噬菌體載體。一般將噬菌體DNA在體外包裝成病毒顆粒后再用于感染受體菌，這樣能大大提高轉(zhuǎn)染效率。（4）λ噬菌體的生活周期：λ噬菌體侵入細(xì)菌后，即可溶菌生長(zhǎng)—即環(huán)狀DNA在細(xì)菌中多次復(fù)制后，合成大量基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，在平皿上形成清亮的噬菌斑；又可溶原生長(zhǎng)—即λDNA整合到細(xì)菌染色體DNA中，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞宿主細(xì)胞不被破裂。

4、柯斯質(zhì)粒（粘粒載體）

1>柯斯質(zhì)粒的概念：粘粒（柯斯質(zhì)粒）是人工構(gòu)建的、具有質(zhì)粒和λ噬菌體DNA載體雙重性質(zhì)的的雜種質(zhì)粒。由λDNA的COS區(qū)(約20-數(shù)百bp)與質(zhì)粒重組而成，在宿主細(xì)胞中可作為正常噬菌體進(jìn)行復(fù)制，但不表達(dá)任何噬菌體的功能。2>粘粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）含有質(zhì)粒載體的抗藥性標(biāo)記和復(fù)制起始位點(diǎn)；（2）一個(gè)或多個(gè)單一限制酶切位點(diǎn)；（3）帶有λ噬菌體粘性末端（COS區(qū)）；（4）具有高容量的克隆能力：分子量?。?-6kb）,但可容納大到40-50kb的外源DNA片段，因此適于構(gòu)建真核生物基因組DNA文庫(kù)。（5）在體外，可包裝成噬菌體顆粒，可轉(zhuǎn)染細(xì)菌。（6）如在粘粒上連接上在真核細(xì)胞生活的元件（復(fù)制區(qū)、啟動(dòng)子及選擇標(biāo)志），則能夠在真核細(xì)胞中生存及表達(dá)。<3>COS質(zhì)粒的應(yīng)用

COS質(zhì)?？稍趩蝹€(gè)重組體中克隆和增殖大片段的真核基因組DNA。cos:cohesive-endsite特點(diǎn)：5、酵母人工染色體載體

酵母人工染色體由酵母染色體的著絲粒(cen4)、自主復(fù)制序列(ARS1)和來(lái)自四膜蟲的端粒(Tel)等功能性DNA序列組成。它可攜帶長(zhǎng)達(dá)200-1000kb的DNA片段，因此在人基因組DNA大片段的克隆中非常有用，是染色體克隆排序的主要工具。用酵母人工染色體克隆DNA的過(guò)程與λ噬菌體相似，將DNA大片段與載體的兩臂相聯(lián)，然后將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母細(xì)胞中，利用載體上的選擇性標(biāo)記進(jìn)行篩選。YAC（酵母人工染色體，yeastartificialchromosome，YAC）是酵母細(xì)胞中用于克隆外源DNA大片段的克隆載體。YAC可以接受100-20000kb的外源DNA的插入，是人類基因組計(jì)劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。BAC（細(xì)菌人工染色體，bacterialartificialchromosome，BAC）是以細(xì)菌的F因子（一種特殊質(zhì)粒）為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，可以插入的外源DNA長(zhǎng)度為300kb。與YAC相比，具有克隆穩(wěn)定、易與宿主細(xì)胞分離等優(yōu)點(diǎn)。BAC是人類基因組計(jì)劃在中基因序列分析的主要載體。MAC（哺乳動(dòng)物人工染色體，mammalianartificialchromosome，MAC）目前也在發(fā)展中。上述載體主要為克隆載體，用于目的基因的克隆、擴(kuò)增、序列分析和體外定點(diǎn)突變等。6、病毒載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。轉(zhuǎn)錄病毒為單鏈RNA病毒，長(zhǎng)約8-10kb。它具有核心蛋白基因、逆轉(zhuǎn)錄酶基因和外殼糖蛋白基因。有些尚有癌基因。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染動(dòng)物細(xì)胞后，以RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，可整合入宿主染色體DNA中。含有強(qiáng)啟動(dòng)子。一般用其人工構(gòu)建型做載體。既病毒+質(zhì)粒=構(gòu)建型病毒載體。構(gòu)建型病毒載體的特點(diǎn)是：1、有廣泛的哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主；2、有較大的基因容量；3、自身含有完整的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；4、通過(guò)感染方法進(jìn)入宿主細(xì)胞，并有效地整合在宿主染色體DNA中。無(wú)論是克隆載體還是表達(dá)載體，都需要導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞使其得到擴(kuò)增或表達(dá)。每一種載體必須選用合適的宿主細(xì)胞，方能得到最佳的克隆和表達(dá)效率。基因工程中使用的宿主細(xì)胞主要有大腸桿菌、酵母細(xì)胞、各種來(lái)源的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞等。使用每一種載體時(shí)，要核對(duì)其對(duì)宿主細(xì)胞的條件需求。第四節(jié)基因工程技術(shù)的基本過(guò)程目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞目的基因的篩選和鑒定一、目的基因(targetDNA)的制備基因工程技術(shù)的第一步是獲得目的基因。目的基因系指待檢測(cè)或待研究的特定基因，亦可稱為供體基因。目前獲得目的基因的方法主要有以下幾種：（一）直接從染色體中分離適用于基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的原核生物中的多拷貝基因。直接從組織或供體中用機(jī)械或合適的限制性內(nèi)切酶將DNA消化后分離獲得。這一方法主要在早期的分子遺傳學(xué)研究中使用，但因該法分離單拷貝基因相當(dāng)困難，目前幾乎不再單純采用這一方法獲得目的基因了。（二）通過(guò)建立基因文庫(kù)分離靶基因 基因文庫(kù)包括兩類：基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，兩種文庫(kù)的建庫(kù)過(guò)程不同，產(chǎn)生的基因結(jié)構(gòu)也不同，因此應(yīng)用范圍也不相同。1、基因組文庫(kù)（1）基因文庫(kù)的概念：基因文庫(kù)（genomiclibrary）是指含有某種生物體（或組織、細(xì)胞）全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體。包括外顯子和無(wú)表達(dá)功能的內(nèi)含子序列。（2）基因文庫(kù)的構(gòu)建

①原核生物目的基因的直接分離從原核生物提取純化的DNA→限制性內(nèi)切酶消化→DNA片段→與載體DNA結(jié)合，構(gòu)成重組體（或直接用放射性探針進(jìn)行雜交）→導(dǎo)入宿主細(xì)胞（形成基因文庫(kù)）→探針釣取目的基因；②真核生物基因文庫(kù)的建立從真核生物細(xì)胞（動(dòng)物生殖細(xì)胞或早期胚胎）提取純化總DNA→限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ消化，當(dāng)DNA平均長(zhǎng)度為20kb左右時(shí)停止消化限制性內(nèi)切酶消化→與λ噬菌體構(gòu)成重組體→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→原位雜交篩選重組體。用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的基本步驟：（1）準(zhǔn)備載體DNA(如置換型λ噬菌體載體)，用適當(dāng)?shù)南拗泼赶⒎蛛x得到載體的左右兩臂；（2）純化真核細(xì)胞高分子量DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗泼覆糠窒?；?）分離適當(dāng)大小的基因組DNA片段（20-24kb）；（4）連接載體與外源ＤＮＡ；（5）

連接產(chǎn)物體外包裝及感染；（6）

基因組文庫(kù)的擴(kuò)增。由于基因組文庫(kù)包含了染色體的所有隨機(jī)片段形成的重組DNA克隆，因此，利用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，就可以從中找出攜帶所需目的基因片段的重組克隆。2、cDNA文庫(kù)法（1）cDNA文庫(kù)的概念：

cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。從cDNA文庫(kù)可以獲得較完整的連續(xù)編碼序列（不含內(nèi)含子），便于表達(dá)成蛋白質(zhì)。（2）cDNA文庫(kù)構(gòu)建步驟：①總RNA提取及mRNA制備：cDNA文庫(kù)的構(gòu)建分成以下幾個(gè)步驟：真核生物的RNA中80%-85%為rRNA（28S，18S，5S三種類型），tRNA和SnRNA（核內(nèi)RNA）則占總數(shù)的10%-15%，這些RNA可采用電泳、密度梯度離心及陰離子交換法等技術(shù)將其分離。mRNA僅占細(xì)胞總RNA的1%-3%，它們大小不一（最大大于7500bp，最小為10bp），而且核苷酸序列也各不相同，但大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3，端均由50-250個(gè)多聚polyA組成，故可制備多聚polyT與之雜交，形成mRNA-dT雜合體，通過(guò)親和吸附層析，既可獲得各種mRNA分子。②cDNA文庫(kù)第一鏈的合成mRNA都帶有polyA尾巴，以多聚polyT（12-18）為引物，mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成與mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA（ss-cDNA），既為第一鏈cDNA。③cDNA文庫(kù)第二鏈的合成在cDNA第一鏈的合成后，模板mRNA通常用RnaseH處理降解，然后以第一鏈為模板合成cDNA第二鏈既為cDNA片斷（ds-cDNA）。④cDNA片斷與載體連接在末端轉(zhuǎn)移酶催化下，分別在雙鏈cDNA分子和線性化質(zhì)粒DNA分子的兩個(gè)3，-末端添加同聚物尾巴（poly-dC和poly-dG）。當(dāng)cDNA與質(zhì)粒分子混合在一起時(shí)，它們可借助粘性末端連接起來(lái)，并在DNA連接酶參與下，形成環(huán)狀的重組DNA分子。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主要步驟：１、

mRNA分離；２、

cDNA第一鏈合成；３、

cDNA第二鏈合成；４、載體與cDNA的連接;５、噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染；6、cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增和保存。⑤cDNA文庫(kù)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：基因的篩選比較簡(jiǎn)單，尤其適用于某些特殊組織基因的制備；準(zhǔn)確性較高，由于每一個(gè)cDNA克隆都包含一種mRNA序列，因而在篩選中出現(xiàn)假陽(yáng)性幾率就會(huì)降低。缺點(diǎn)：只能反映外顯子序列結(jié)構(gòu)，不能反映整個(gè)基因序列，因而無(wú)法研究基因編碼區(qū)外側(cè)調(diào)控序列的結(jié)構(gòu)和功能。cDNA的合成第一鏈合成時(shí)，反轉(zhuǎn)錄酶需要一個(gè)引物以延伸合成mRNA模板的拷貝，通常用的引物是寡聚dT第二鏈合成cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

3、化學(xué)合成法制備DNA片段：主要用于一些小的DNA片段的合成。如用DNA合成儀合成．4、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法擴(kuò)增基因片段 對(duì)于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（ＰＣＲ），以基因組DNA或cDNA模板擴(kuò)增得到目的基因片段。二

、

DNA分子的體外連接

(一)體外重組概念：體外重組亦稱為體外連接。既將目的DNA與載體DNA在體外相連，形成重組體的過(guò)程，其產(chǎn)物常常稱為重組子。重組體是由兩種不同來(lái)源的DNA組合而成，所以又稱為異源嵌合DNA。整個(gè)過(guò)程是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，連接本質(zhì)上是一個(gè)酶促反應(yīng)過(guò)程，需各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶等作用。

(二)常用的連接方法

根據(jù)DNA片段末端類型，目的基因與載體DNA連接可分為下列幾種類型：1、粘性末端連接法以同一種限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNA，獲得相同的粘性互補(bǔ)末端，在一定溫度下，兩者的粘性末端互補(bǔ)配對(duì)，再經(jīng)DNA連接酶將其連結(jié)，形成一個(gè)重組DNA分子。該法按目的基因與載體的連接方式不同又可分為：

①插入失活法將外源目的基因插入載體選擇性標(biāo)記處，并使其失活的連接方法稱為插入失活法。本法一般使用同一種限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒與目的DNA而產(chǎn)生相同的粘性末端，在DNA連接酶作用下連接起來(lái)，形成重組體。如外源目的基因插入質(zhì)粒載體抗性基因處，并使其失活。本法比較簡(jiǎn)單，但其缺點(diǎn)是連接反應(yīng)易產(chǎn)生目的基因與載體的自我環(huán)化。②定向克隆法將外源基因按正確的方向插入載體的方法稱為定向克隆法。粘性末端連接法優(yōu)點(diǎn)是：簡(jiǎn)單，重組率高。缺點(diǎn)是：易產(chǎn)生載體的自身環(huán)化，或載體間連接而產(chǎn)生較高的假陽(yáng)性克隆。粘性末端連接法用途：該法適合制備目的DNA片段。因是用同一限制性內(nèi)切酶切割后形成的重組體，克隆繁殖后仍用此酶消化，既可回收到大量拷貝的目的DNA片段。2、平齊末端連接法

以同一種限制性內(nèi)切酶切割目的基因和載體DNA，限制性內(nèi)切酶從識(shí)別序列對(duì)稱軸的中間切開，產(chǎn)生平齊末端。在高濃度DNA，大量T4DNA連接酶存在時(shí)，可以直接利用平端將目的基因與載體連接起來(lái)。平端連接的優(yōu)點(diǎn)是可用T4連接酶連接任何DNA平端，這對(duì)不同DNA分子的連接十分有利。因?yàn)槌讼嗤虿煌拗泼该盖挟a(chǎn)生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被補(bǔ)齊或削平，實(shí)現(xiàn)平端連接。（1）5’-突出粘性末端的補(bǔ)齊 限制酶降解產(chǎn)生的5’-端突出的粘性末端，可用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）補(bǔ)齊。（2）3’-突出粘性末端的削平 含3’-突出的粘性末端可用T4DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性補(bǔ)平。 平端連接的主要問(wèn)題是，它的連接效率比粘性末端低，因此需較多的T4DNA連接酶和較高的底物濃度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促進(jìn)平端連接反應(yīng)。該法的優(yōu)點(diǎn)是：可防止自身環(huán)化；缺點(diǎn)是：重組率低。3、人工接頭連接法

對(duì)平端DNA片段，可借助人工合成的接頭來(lái)方便連接。所謂人工接頭子又稱為銜接物，是人工合成的大小約８-12個(gè)核苷酸并具有RE識(shí)別位點(diǎn)的平齊末端雙鏈寡核苷酸迥文序列。接頭子是平端，在磷酸化后通過(guò)T4DNA連接酶可與大多數(shù)平端DNA連接。連接后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，可產(chǎn)生所需要的粘性末端。這種接頭法適合于沒有所需RE位點(diǎn)的外源DNA。4、適配子連接法

適配子是人工合成的具有一個(gè)以上限制酶識(shí)別位點(diǎn)的短序列，它具有一個(gè)平端，可與其它DNA的平端連接，同時(shí)它還有某種限制酶的突出端，可與含互補(bǔ)的限制酶突出端的DNA片段連接，連接后，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钣挚僧a(chǎn)生所需要的突出粘端。

5、同聚物加尾法在末端轉(zhuǎn)移酶催化下給載體DNA和目的DNA分子末端添加多聚dA和dT，形成粘性末端，而進(jìn)行連接。該法不需要模板鏈的存在，可防止載體DNA與目的DNA的自身環(huán)化。同聚物接尾法三、重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。（一）受體細(xì)胞：受體細(xì)胞又稱為宿主細(xì)胞，可分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞兩大類。（1）原核細(xì)胞：以大腸桿菌為主，其次有枯草桿菌、鏈球菌。（2）真核細(xì)胞：有酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞。前者多用于基因的復(fù)制、擴(kuò)增，后者一般用作基因表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。（二）受體細(xì)胞選擇（1）必須是限制性內(nèi)切酶的缺陷型，既R-（RestrictionNegative）菌株，以防止外源性DNA被破壞；（2）必須是DNA重組缺陷型株既Rec-（recombinationnegative）菌株，以保證不改變導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外源DNA特性，使重組體較穩(wěn)定。（3）必須是感受態(tài)細(xì)胞或能成為感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞:是指宿主細(xì)胞處于最適宜攝取或容忍重組體的狀態(tài),即容易接受外源DNA的狀態(tài),此稱為細(xì)胞的感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞制備：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌→低滲CaCl2溶液處理（冰預(yù)冷，12-24小時(shí)）→細(xì)胞通透性增大→成為感受態(tài)細(xì)胞。重組DNA分子引入受體細(xì)胞常用的途徑有轉(zhuǎn)化（或轉(zhuǎn)染）、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射和電穿孔等多種不同方式。（三）重組體導(dǎo)入大腸桿菌：（1）氯化鈣轉(zhuǎn)化法：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌懸浮于冰預(yù)冷的低滲CaCl2溶液處理（12-24小時(shí)）→細(xì)胞通透性增大→成為感受態(tài)細(xì)胞→然后加入重組質(zhì)粒，使DNA與Ca形成復(fù)合物吸附于細(xì)胞表面→420C、90秒熱休克處理→重組DNA進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率：是指每微克DNA轉(zhuǎn)化受題細(xì)胞后所獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)。（2）轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染：以噬菌體和真核病毒作載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊的形式。因噬菌體具有自動(dòng)侵入細(xì)胞的功能，，所以宿主細(xì)胞不需要預(yù)先處理。但噬菌體需體外包裝，使其成為成熟顆粒，以提高轉(zhuǎn)染綠。裸露λDNA分子重組體與經(jīng)過(guò)包裝的λDNA重組體分子比較，后者的轉(zhuǎn)染率高100-1000倍。（四）重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移效率大大低于大腸桿菌，因而發(fā)展了多種基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)，下面分別簡(jiǎn)介如下：（1）物理方法①顯微注射法：使用非常微細(xì)的玻璃毛細(xì)管（玻璃針）攜帶DNA，在顯微鏡下直接將外源DNA注射到細(xì)胞核中，然后將導(dǎo)入外源基因的受精卵經(jīng)體外培養(yǎng)后，作胎胚移植。本法適應(yīng)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究。②電穿孔法：外源DNA與哺乳動(dòng)物細(xì)胞放于特制裝置內(nèi)，置于高壓脈沖電場(chǎng)作用下，哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜被電脈沖作用產(chǎn)生瞬間可逆性穿孔，外源DNA從膜孔進(jìn)入，整合到基因組中。本法適用于磷酸鈣共沉淀法無(wú)效的細(xì)胞系。（2）化學(xué)法①DNA-磷酸鈣轉(zhuǎn)染法：DNA-磷酸鈣轉(zhuǎn)染法（transfectionof