分子醫(yī)學實用技術實驗1-1

分子醫(yī)學實用技術

實驗一堿法小量制備質粒DNA質粒DNA的雙酶切實驗二DNA瓊脂糖凝膠電泳DNA紫外分光光度法定量測定課堂安排質粒提取與雙酶切（講解）、離心技術（錄像）質粒提取操作酶切1h(講解瓊脂糖電泳，分光光度技術）電泳錄像核酸分子是分子生物學的主要研究對象，核酸的分離與純化是分子生物學研究中的基本技術，樣品質量將直接影響實驗的成敗。質粒

存在于細菌體內的一類獨立于染色體的自主復制的遺傳成分，在細胞內它們常以共價閉環(huán)的超螺旋形式存在。

質粒DNA的一般特性：質粒是細菌內的共生型遺傳因子，有相對獨立性。它能在細菌中垂直遺傳并賦予宿主細胞一些表型是雙鏈閉合環(huán)狀DNA，分子量大小不等質粒DNA與宿主菌染色體DNA的兩點不同：★宿主菌染色體DNA通常比質粒DNA要大得多★純化分離的宿主菌DNA多為線性分子，而質粒DNA呈閉合環(huán)的形式。

質粒常用作基因工程載體：

重組質粒DNA提取原理與方法

核酸分離純化的基本原則：保證核酸一級結構完整排除其他分子的污染蛋白質、脂類、糖、有機溶劑、金屬離子、外源DNA、RNA注意事項

保證一級結構完整性的策略盡量簡化操作步驟減少化學因素對核酸的降解（如過量酸堿）減少物理因素對核酸的降解（機械剪切力：強烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復凍融；高溫等）防止核酸的生物降解（核酸酶的預防）

分離純化質粒DNA的方法SDS堿裂解法煮沸法highpureplasmidisolationkit等。原理:利用兩種DNA的差異進行分離基本步驟1.培養(yǎng)細菌使質粒擴增（DNA的擴增與選擇)2.細菌的收集與裂解收集——高速離心的方法裂解細菌方法：去污劑法、有機溶劑法、堿變性法、沸水熱裂法、溶菌酶法、超聲處理法等。

根據質粒的大小、宿主菌菌株及裂解后的純化方法等因素進行選擇3.質粒DNA的純化常用的方法有：超速離心層析法聚乙二醇沉淀法等所有純化方法都是利用了質粒DNA相對較小及共價閉合環(huán)狀的性質。SDS堿裂解法制備質粒DNA的原理

在有EDTA、溶菌酶及表面活性劑（SDS）存在的條件下，用堿處理細菌，可以使細菌的細胞壁破裂，釋放出細胞內容物（染色體DNA、蛋白質和RNA等），高堿環(huán)境（pH12.0~12.6）可以使細菌線性分子染色體DNA氫鍵斷裂，雙鏈解開變性，而質粒DNA的超螺旋共價閉合環(huán)狀的雙鏈并不完全分離，當加入高濃度酸性鹽時，buffer中的pH恢復至中性，并在有高鹽存在的條件下：變性染色體DNA凝聚成不溶性沉淀物；變性的蛋白質與SDS形成的復合物在高鹽環(huán)境中也形成沉淀；小分子的質粒DNA又呈天然構型，能溶解在buffer中，這樣通過離心可以把線粒體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起除去。如果要提高DNA的純度，則可以用RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去殘留的蛋白質。SDS堿裂解法抽提質粒的主要試劑

溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl組成.

葡萄糖:

增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用,防止破壞質粒.

EDTA

:絡合鎂等二價金屬離子,防止

DNA酶對質粒分子的降解作用。

Tris?Cl:

使溶菌液維持溶菌作用的最適PH

范圍。溶液II：由SDS（十二烷基磺酸鈉）與NaOH組成

SDS:

解聚核蛋白并與蛋白質分子結合使之變性；

NaOH:

破壞氫鍵，使DNA分子變性。溶液III：中和溶液Ⅱ的堿性，使染色體DNA復性而發(fā)生纏繞并使質粒DNA復性實驗步驟及注意事項加1.5ml培養(yǎng)物于EP管，12000g×30s

充分除去上清，加入冰的200ul溶液I，震蕩EP管，搖勻

加入200ul溶液II，快速顛倒數(shù)次

加入150ul冰溶液III，顛倒10s，冰浴5min，

12000g×5min

轉移上清到新EP管，加入等體積酚混勻，冰浴3min，12000g×5min

上清加等體積氯仿異戊醇

混勻，冰浴3min，12000g×5min

將水相移入新的EP管，加入2倍體積的乙醇，-20℃放置15min，12000g×5min充分棄上清，沉淀中加入1ml70%乙醇，

12000g×2min質粒DNA雙酶切關于限制性核酸內切酶及其切割方式限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+EcoRⅠ

回文結構Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口

定向克隆EcoRⅠ切割位點HindIII切割位點+EcoRⅠ+HindIII雙酶切EcoRⅠ+HindIII雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGA限制性核酸內切酶的主要應用建立DNA分子的限制酶圖譜和疾病診斷。構建基因文庫。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。改建質粒。影響限制性核酸內切酶酶切的因素影響限制性核酸內切酶酶切的因素:DNA底物的純度、結構、甲基化狀態(tài)；酶切緩沖液：（區(qū)分單酶切和雙酶切）

Tris-HCl50mmol/LpH7.5MgCl210mmol/LNaCl0-100mmol/LDTT1mmol/L（或BSA）

Volume20-100μL

溫度：一般為37℃

時間：1-1.5hEcoRI和HindIII對重組pUC119質粒共切割主要試驗試劑質粒、EcoRI和HindIII及其酶切緩沖液無菌水操作在一無菌EP管中建立反應體系：(l)ddH2O8l10×buffer2l

質粒DNA10l

EcoRI10l

HindIII

總體積20l37℃保溫1~2h注意事項關于酶的保存：低溫、液態(tài)甘油（50%）有利于保存酶，但影響酶活性酶量達或時間長，會導致星活性終止反應瓊脂糖凝膠電泳法凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用技術根據制備凝膠的材料:

瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳瓊脂糖凝膠電泳的用途與特點

瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標準方法。特點:操作簡便快速可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小、構象及電荷數(shù)不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶DNA顯色劑多用EB，它能和堿基間的氫鍵結合，在波長為254nm~365nm的紫外光照射下呈橘紅色（530nm）的熒光。原理瓊脂糖電泳分離DNA的范圍瓊脂糖可以形成各種形狀、大小的孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。電泳指示劑：常用指示劑溴酚藍（bromophenolblue,Bb）呈藍紫色二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍慢。膠濃（%）溴酚藍二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb影響凝膠電泳的因素

在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:

DNA分子大小線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比。瓊脂糖濃度一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。影響凝膠電泳的因素DNA分子的構象

當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而線狀雙鏈DNA移動最慢。電源電壓

在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大,所加電壓不得超過5v/cm。影響凝膠電泳的因素嵌入染料的存在染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15％。離子強度影響緩沖液的組成及離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

實驗材料

電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。材料：重組pUC119質粒DNA溶液,重組pUC119質粒的雙酶切產物瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），

10X加樣緩沖液：Ⅰ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液;Ⅱ0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液實驗步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。也可電泳完畢后將膠浸于EB溶液中10分鐘，爾后清水浸泡10分鐘后紫外等下觀察）⑵插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入膠模，室溫冷卻凝固⑶小心垂直向上拔出梳子，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。(4)將4μl的6X載樣緩沖液加入酶切反應管中，混勻后，小心加入點樣孔（1）。5ul質粒加1ul6X載樣緩沖液點樣（2）⑸打開電源開關，調節(jié)電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶。結果與分析

圖1基因組DNA1%瓊脂凝膠電泳圖123M123M123LC型質粒DNA點樣孔細菌基因組DNAOC型質粒DNASC質粒DNA細菌RNA結果與分析

圖2

PCR產物瓊脂凝膠電泳圖

(1、2、3、4為PCR產物，M為DL2000Marker)注意事項1倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60℃，否則溫度太高會使制板變形2膠一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要豎直向上，不要弄壞點樣孔3點樣時槍頭下伸，點樣孔內不能有氣泡，緩沖液不要太多4EB染料有毒（強致癌物），切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境，膠勿亂扔5紫外線觀察不要太久常見問題（討論）：1、提取的DNA不純：變性不充分；關鍵過程反應時間過短；離心時間或速度不夠。

2、提取的DNA成涂布狀：操作過程中用力過猛，操作系統(tǒng)有污染。

3、與細胞器DNA分離不全；變性過程不完全；試劑配置問題紫外分光光度技術分光光度技術是利用物質特有的吸收光譜對其進行定性、定量分析的實驗技術特點靈敏度高：測定下限可達10－5～10－6mol/L,

準確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2～5％（1～2％）操作簡便快速應用廣泛

吸光光度法是基于被測物質的分子對光具有選