實(shí)驗(yàn)五 酵母菌形態(tài)的觀察和顯微鏡下細(xì)胞測(cè)量和計(jì)數(shù)

#實(shí)驗(yàn)五酵母菌形態(tài)的觀察和顯微鏡下細(xì)胞測(cè)量和計(jì)數(shù)劉洋生物1011002040120一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察酵母菌的形態(tài)，掌握區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞的染色方法。2、掌握利用顯微測(cè)微尺測(cè)量酵母菌人小的方法。3、學(xué)習(xí)利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)量的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理（一）酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌是單細(xì)胞真核微生物，細(xì)胞呈圓形、橢圓形或柱狀。酵母的細(xì)胞比細(xì)菌人得多，經(jīng)過(guò)特殊的染色，在高倍鏡下就可以觀察到。酵母菌既可無(wú)性繁殖，又可有性繁殖。無(wú)性繁殖有芽殖和裂殖兩種，芽殖又有單出、雙出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4〃8個(gè)子糞飽子。在一定條件卞，有的酵母菌進(jìn)行芽殖后，長(zhǎng)人的子細(xì)胞不與母細(xì)胞立即分離，并繼續(xù)出芽，細(xì)胞成串排列，這種菌絲狀的細(xì)胞串就稱為假菌絲。假菌絲的各細(xì)胞間僅以狹小的面積相連，呈藕節(jié)狀。酵母菌的死活細(xì)胞可以通過(guò)美蘭染色加以區(qū)分。美蘭是一種無(wú)毒性染色劑，其氧化型為藍(lán)色，還原型為無(wú)色。由于活細(xì)胞具有較強(qiáng)的還原能力，可以使美蘭由藍(lán)色的氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)色的還原型。處于代謝旺盛的細(xì)胞還原美蘭的能力強(qiáng)，細(xì)胞為無(wú)色，為代謝緩慢的老細(xì)胞、幼嫩芽體為淺藍(lán)色，死細(xì)胞為深藍(lán)色。（-）顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)本次實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)。方法是將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌體細(xì)胞或抱子懸液，加到血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室內(nèi)，在顯微鏡下逐格計(jì)數(shù)。因?yàn)橛?jì)數(shù)室的容積是固定的（0.1mm3）,所以可以將在顯微鏡下計(jì)得的菌數(shù)換算成單位體積試樣中的菌數(shù)。血球計(jì)數(shù)板使一塊特制的載玻片，中部有H形的溝槽將中部分成上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室方格的邊長(zhǎng)為3mm,每個(gè)方格分為9個(gè)人方格，正中央的人方格被分為25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又被分為16個(gè)小方格。這樣正中央的人方格總共分成400個(gè)小方格，每個(gè)小方格的體積為l/4000mm3（計(jì)數(shù)室的高度為0.1mm）o由此得到如下公式：/、平均每個(gè)中方格內(nèi)的菌數(shù)每亳升的菌數(shù)（個(gè)）=————J…%桶釋倍數(shù)x4000x1000（三）顯微鏡下細(xì)胞大小的測(cè)量用來(lái)測(cè)屋微生物人小的工具有目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺專用于校正目鏡測(cè)微尺每格的長(zhǎng)度，是中央部分可有精確等分線的載玻片。全長(zhǎng)1mm,等分為100小格，每小格長(zhǎng)lO^io目鏡測(cè)微尺的刻度刻在一個(gè)略小于目鏡內(nèi)徑的圓玻璃片上。將此測(cè)微尺放在目鏡內(nèi)觀察物彖時(shí)，可同時(shí)看見(jiàn)物象和測(cè)微尺，但是在配合不同放人倍數(shù)的物鏡時(shí)，目鏡測(cè)微尺每刻度間的長(zhǎng)度會(huì)發(fā)生變化。所以，目鏡測(cè)微尺不能直接用來(lái)測(cè)量微生物的大小，使用前必須利用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正。三、實(shí)驗(yàn)材料1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、熱帶假幺纟酵母（Candidatropicalis）2、染色劑：0.2%美蘭染液3、培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）4、其他：血球計(jì)數(shù)板、鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺、載玻片、蓋玻片、無(wú)菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具

四、實(shí)驗(yàn)方法（一）酵母菌的形態(tài)觀察2、芽殖觀察（2）制片：取一潔凈載玻片，在其中央滴一滴美蘭染液，用接種環(huán)取少量釀酒酵母菌苔在染液中涂勻。再用躡子取一蓋玻片，以45°角與菌懸液接觸后，輕輕蓋在菌懸液上，避免產(chǎn)生氣泡，用吸水紙吸干多余液體。（2）觀察：將水壓片置于高倍鏡卞觀察。觀察芽殖和死、活細(xì)胞的顏色。30min之后，再次觀察死、活細(xì)胞數(shù)是否發(fā)生了變化。2、假菌絲的觀察（1）培養(yǎng)：將熱帶假絲酵母劃線接種與馬鈴萼葡萄糖培養(yǎng)基平板表面，28'C培養(yǎng)2天，取出培養(yǎng)物,在無(wú)菌條件下，將一實(shí)現(xiàn)滅菌的無(wú)菌蓋玻片輕輕壓在劃線處，繼續(xù)培養(yǎng)2天。（2）觀察：打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，與高倍鏡下直接觀察3、釀酒酵母菌子囊范子的觀察于高倍鏡下觀察子囊孑包子裝片，注意子囊抱子的數(shù)目和形狀。（二）顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)1、制備菌懸液：用無(wú)菌接種環(huán)在釀酒酵母菌斜面上刮卞適量菌苔，將菌苔分散在盛有5ml無(wú)菌水的試管中，充分振蕩。2、加菌液：先用擦鏡紙將血球計(jì)數(shù)室擦凈，用無(wú)菌滴管取著涼釀酒酵母菌懸液滴入上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)，蓋上蓋玻片，不能有氣泡，否則重做。3、計(jì)數(shù)：現(xiàn)在顯微鏡下找到計(jì)數(shù)室，在正中央的大方格中沿對(duì)角線取9個(gè)中方格，計(jì)數(shù)每個(gè)中方格中的菌數(shù)，填入下表，并計(jì)算單位體積的菌數(shù)（個(gè)/ml）。（三）顯微鏡下細(xì)胞大小的測(cè)量2、校正目鏡測(cè)微尺（1）安裝目鏡測(cè)微尺：取出目鏡，旋開(kāi)透鏡螺旋，將目鏡測(cè)微尺刻度朝卞放入目鏡筒，然后旋好螺旋，插入顯微鏡筒。（2）放置鏡臺(tái)測(cè)微尺：將鏡臺(tái)測(cè)微尺放在載物臺(tái)上，使刻度面朝上。（3）校正：在顯微鏡卞觀察，調(diào)準(zhǔn)焦距，當(dāng)看清鏡臺(tái)測(cè)微尺后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行，然后移動(dòng)推動(dòng)器，使目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺的某一區(qū)間的兩條刻度線完全重合，在數(shù)出兩條重合先之間各自所占的格數(shù)，根據(jù)公式得到校正后的目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度Gum）目鏡測(cè)微尺每小格的長(zhǎng)度Gum）=兩條重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)x10

兩條重合線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)2、制釀酒酵母水壓片：取一潔凈載玻片，在中央滴一滴上面制備的菌懸液，小心蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余的液體吸干，不能產(chǎn)生氣泡。3、測(cè)量釀酒酵母菌體人小：將釀酒酵母水壓片放在載物臺(tái)上，在顯微鏡下看清菌體后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)量酵母細(xì)胞菌體的直徑，共需測(cè)量20個(gè)細(xì)胞。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析（一）酵母菌的形態(tài)觀察1、美蘭染色后，觀察到視野中細(xì)胞呈圓形或橢圓形，人部分呈白色，少部分呈藍(lán)色?？梢?jiàn)芽殖，較人

的母體細(xì)胞旁邊有一較小的芽體，母體細(xì)胞白色，芽體淺藍(lán)色。而在子囊泡子的觀察中，可見(jiàn)四個(gè)呈菱形的子囊范子靠在一起，相互之間以及范子于壞境之間都有透明的子囊壁隔開(kāi)。芽殖和子囊施子如下圖1所示。2、假菌絲的觀察（-）顯微鏡下的細(xì)胞計(jì)數(shù)將計(jì)得菌數(shù)填入卞表2。表2釀酒酵母的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)格數(shù)123456789平均數(shù)數(shù)目5665765345375根據(jù)公式，計(jì)算所得單位體枳的菌數(shù)如卜?:

每亳升的菌數(shù)（個(gè)）=平均每個(gè)中方格內(nèi)的菌數(shù)16X桶釋倍數(shù)X4000X10005.37516每亳升的菌數(shù)（個(gè)）=平均每個(gè)中方格內(nèi)的菌數(shù)16X桶釋倍數(shù)X4000X10005.37516（三）顯微鏡卞細(xì)胞人小的測(cè)量1、目鏡測(cè)微尺的校正結(jié)果表2目鏡測(cè)微尺刻度的校正物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)（pm）高倍鏡402052.52、測(cè)量結(jié)果表3釀酒酵母細(xì)胞人小的測(cè)量菌細(xì)胞編號(hào)123456目鏡測(cè)微尺格數(shù)（長(zhǎng)軸）4.34.34.53.24.65.2目鏡測(cè)微尺格數(shù)（短軸）4.34.12.52.74.13.6菌體大?。╱m*um）115.6110.270.354.0117.9117.0菌細(xì)胞編號(hào)78910平均數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)（長(zhǎng)軸）4.54.94.14.94.4目鏡測(cè)微尺格數(shù)（短軸）1.82.52.72.83.6菌體大?。╱m*um）50.676.669.285.896.5由上表可知，釀酒酵母細(xì)胞平均人小為4?4X3?6pm,而細(xì)胞的人小范圉是（3?2~5?2）X（2?8~4?3）屮m3、班級(jí)數(shù)據(jù)匯總：3.1釀酒酵母的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(EB藝昱=込0&0_(EB藝昱=込0&0_denistyMin.:1750001stQu.:1087500Median:1500000Mean:38399583rdQU.:3527778Max.:39444444

3.2釀酒酵母細(xì)胞人小的測(cè)量描述性統(tǒng)汁結(jié)果:ID_O長(zhǎng)鞘ID_O長(zhǎng)鞘Min.:3.3101stQu.:6.362Median:9.100Mean:8.2803rdQU.:10.012Max.:16.200短軸Min.:1.6101stQu.:3.975Median:5.885Mean:5.4853rdQU.:7.135Max.:11.900長(zhǎng)軸短軸酵母細(xì)胞大小測(cè)量六、思考題用美蘭染色時(shí)，如何在光學(xué)顯微鏡下區(qū)分酵母細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱？用光學(xué)顯微鏡觀察酵母菌體時(shí)，其在制片和染色方面與細(xì)菌有何差別？為什么說(shuō)熱帶假絲酵母的菌絲是假菌絲？七、總結(jié)1＞制備待計(jì)數(shù)菌懸液時(shí)，為避免無(wú)菌水中菌體密