肽與蛋白質(zhì)HPLC分析和純化手冊(cè)

第一章 簡(jiǎn)介：肽和蛋白質(zhì)的反相HPLC分析與純化反相高效液相色譜〔RP-HPLC〕已經(jīng)成為一種分析和純化生物分子廣泛而牢靠的方法。RP-HPLC在肽、蛋白質(zhì)分析和純化方面的重要作用在于它的分別度：RP-HPLC能夠分別具有個(gè)氨基酸殘基的多肽通常可以用RP-HPLC1變異物的分子量都在5300異物都可以用RP-HPLC亞甲基的不同——兔胰島素有一個(gè)蘇氨酸，而人胰島素有一個(gè)絲氨酸！RP-HPLC圖1.RP-HPLC分別含有一個(gè)不同氨基酸的人和兔胰島素。色譜柱：VYDAC214TP54洗脫液：27-30%ACN+0.1%TF1.5mL/mi25mi。科學(xué)文獻(xiàn)中已有很多用RP-HPLC生長(zhǎng)因子與其未氧化態(tài)類似物已得到分別，白細(xì)胞介素-2突變蛋白也已經(jīng)得到分別。在最近的論文中，KunitaniRP-HPLC30-2。他們得出結(jié)論：蛋白質(zhì)的構(gòu)造在反相分別中格外重要，同時(shí)，RP-HPLC也能用來爭(zhēng)論蛋白質(zhì)的構(gòu)造。在該過程中，他們呈現(xiàn)了RP-HPLCRP-HPLCRP-HPLC于純化克及毫克量的合成肽。RP-HPLC能用于分別血紅蛋白變體，鑒別微粒種類，爭(zhēng)論酶亞基和細(xì)胞功能。RP-HPLC還能純化用于序列測(cè)定的微量級(jí)肽，并純化治療用的毫克級(jí)到千克級(jí)生物技術(shù)衍生多肽。反相HPLC廣泛用于生物制藥領(lǐng)域的蛋白質(zhì)治療制品的分析。通過分析蛋白質(zhì)治療制品的酶消化物能識(shí)別蛋白質(zhì)，并檢測(cè)基因變化與蛋白質(zhì)降解〔脫酰氨和氧化〕產(chǎn)物。用RP-HPLCVYDAC就已呈現(xiàn)指數(shù)級(jí)的增長(zhǎng)，如圖〔又見參考資料7。GraceVydacHPLC2。美國(guó)專利局公布的1984-2023VYDAC?反相HPLC其次章多肽與RP-HPLC色譜柱的作用機(jī)制了解多肽與反相外表的作用機(jī)制對(duì)于理解RP-HPLC〔3了。多肽/反相之間相互作用的吸附/脫附模型圖3.流淌相中的多肽進(jìn)入色譜柱。多肽的“疏水腳”吸附到疏水性的反相材料外表，當(dāng)有機(jī)調(diào)整劑濃度升到臨界濃度時(shí)，多肽就脫附下來了。可以認(rèn)為多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大局部都暴露在流淌相中，只有RP-HPLC是基于多肽之間“疏水腳”的微小差異“疏水腳”的不同源于氨基酸序列的不同與構(gòu)造的不同。多肽與疏水相之間吸附/脫附機(jī)制的關(guān)鍵〔Geng和RegnierZ”值格外準(zhǔn)確，所以脫附只在很狹窄的有機(jī)調(diào)整劑濃度范圍內(nèi)發(fā)生〔圖敏感性，是分別多肽時(shí)RP-HPLC具有選擇性的緣由。當(dāng)?shù)竭_(dá)臨界濃度時(shí)，多肽突然脫附并產(chǎn)生尖峰。“Z”值對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)造的敏感性和在調(diào)整劑臨界濃度時(shí)的突然脫附，使得RP-HPLC能分別格外相像的多肽〔見第2頁(yè)〕。分子保存時(shí)間與有機(jī)調(diào)整劑濃度圖4.A：由于是通過安排而保存，聯(lián)苯等小分子的保存時(shí)間隨著有機(jī)調(diào)整劑濃度的增加而漸漸削減：當(dāng)有機(jī)調(diào)整劑濃度到達(dá)能脫附多肽的臨界濃度時(shí)，溶解酵素等多肽的保存時(shí)間發(fā)生突然而猛烈的變化，證明白多肽—反相外表之間相互作用的吸/脫附模型。使多肽能夠得以分別的“疏水腳”對(duì)分子構(gòu)造格外敏感。RP-HPLC對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)造的敏感Kunitani和Johnson覺察，由于構(gòu)造的差異，格外相像的白細(xì)胞介素-2突變蛋白也能得到分別，包括Geng和Regnier“Z”值多肽在色譜柱中的吸附/脫附只發(fā)生一次。脫附后，多肽和反相柱子外表就沒有什么相互作用了，隨后的相互作用也不會(huì)對(duì)分別產(chǎn)生多少影響。機(jī)調(diào)整劑濃度的敏感性如圖5所示。溶菌酶的保存時(shí)間發(fā)生了很大變化，而乙腈的濃度相對(duì)地只有微小變化。多肽的保存時(shí)間對(duì)調(diào)整劑濃度微小變化的敏感性使得等度洗脫比較困難，由于有機(jī)調(diào)整劑地濃度必需維持在格外準(zhǔn)確的范圍內(nèi)。多肽RP-HPLC分別通常承受梯度洗脫，即使梯度很小〔即單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)調(diào)整劑濃度變化很小〕。乙腈濃度對(duì)洗脫的影響圖5.ACN濃度為39%時(shí)，溶解酵素的保存時(shí)間約18ACN40%時(shí)，保存時(shí)間削減一半還多，只有7.6分鐘。ACN42%時(shí)，溶解酵素的保存時(shí)間又削減一半，只3.1分鐘。色譜柱：VYDAC214TP54洗脫液：39%、40%、42%ACN+0.1%TFA。當(dāng)?shù)榷确謩e不適用時(shí)，可以承受小梯度有效地分別相像的多肽。小肽進(jìn)展色譜分別時(shí)安排和吸附同時(shí)發(fā)生。當(dāng)有機(jī)調(diào)整劑濃度變化時(shí)，它們脫附的速度比發(fā)生安排的小分子要快，但與蛋白質(zhì)相比，它們是漸漸脫附的〔圖6〕，說明其分別機(jī)制由此可見，螺旋狀肽上疏水殘基的準(zhǔn)確位置，在推想肽的保存值時(shí)很重要。由于大的多肽集中緩慢，所以其RP-HPLC的峰比小分子的要寬。等度洗脫的多肽的峰寬5-10等度洗脫。肽的保存時(shí)間圖6.RP-HPLPentaphenylanin苯脫附得快，但比溶菌酶慢。小肽的色譜機(jī)理似乎是混合的。HPLC分別中色譜柱的作用HPLC色譜柱為多肽吸附供給疏水性的外表。色譜柱由不銹鋼管構(gòu)成,內(nèi)部填充微徑、球形聚合物〔比方聚苯乙烯-二乙烯基苯〕也可以用作多肽的HPLC吸附劑。吸附劑的孔徑HPLC吸附劑是多孔微粒，用于反響的外表大局部位于小孔中。因此，多肽分子必需進(jìn)入孔中才能被吸附和分別。HPLC曾多年使用孔徑約100?大而無法進(jìn)入這種直徑的孔中。GraceVydac為HPLC改進(jìn)的大孔徑(～300?)球形硅膠微粒宣告了用RP-HPLC有效分別多肽的開頭。今日，雖然有些肽(<～2023MW)也能用100?孔徑的微粒分別，但大多數(shù)多肽都是用孔徑約300?的微粒填充色譜柱來完成分別的。吸附劑粒度色譜柱中吸附劑的粒度影響洗脫峰寬，小直徑的微粒通常產(chǎn)生更尖的峰和更高的分別度。毛細(xì)分析和少量制備分別推舉使用5〔色譜柱內(nèi)徑10mm譜柱通常裝填10μm的材料。內(nèi)徑大于22mm的過程色譜柱通常裝填15μm或更大的微粒，其粒度安排也比用于分析型色譜柱的寬〔見40-42頁(yè)〕。色譜柱的選擇與樣品分子的特性7.不同分子量和疏水性所推舉的粒度和結(jié)合力吸附相種類PLC吸附劑，這些硅膠基質(zhì)分子上有一個(gè)能附著疏水基團(tuán)的活性氯基。形成疏水相的烴基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的線性脂肪族烴。烴鏈的長(zhǎng)度在蛋白質(zhì)分別效果上一般沒有什么不同75000道爾頓的小分子蛋白質(zhì)最好選用C18色譜柱。最小的分子和最親水的肽通常在小孔的C18柱子上分別得最好。大于5000道爾頓的蛋白質(zhì)或小分子多肽格外疏水，最好選用C4色譜柱。C8柱與C18色譜柱的應(yīng)用差不多，但分別C4多肽表現(xiàn)出獨(dú)特的選擇性。反相外表的微小差異有時(shí)會(huì)造RP-HPLC對(duì)多肽選擇性的不同，可以利用這一點(diǎn)來優(yōu)化特定肽的分別。如圖8所示，肽分別的選擇性可能受疏水外表性質(zhì)的影響。圖中所示的五種肽的選擇性在C18和C4C4C18在C18柱上稍長(zhǎng)。不同反相色譜柱上的肽分別圖8.色譜柱：VYDAC218TP54(C18);214TP54(C4);219TP54〔苯基〕洗15-30%ACN+0.1%TF1.0mL/mi30min123I，4.5.I血管緊急素I含有一個(gè)組胺酸，血管緊急素II含有兩個(gè)組胺酸。在苯基柱子上，這兩者都比其它肽洗脫得早。分別肽時(shí)〔比方蛋白質(zhì)消化物中的肽〕，最好試用不同的疏水相，以選出針對(duì)特定肽混合物具有最正確選擇性的相來。肽的RP-HPLC分別基于肽和反相外表之間的微妙作用。反相外表的微小變化能影響肽的分別，雖然小但很重要。有些肽的分別對(duì)鍵合在硅膠基質(zhì)上的疏水相的密度和均勻度格外敏感〔圖9〕。低碳裝填色譜柱分別度的提高圖9.C18RP-HPL色譜柱〕分別在標(biāo)準(zhǔn)碳裝填色譜柱〕上只有局局部別的兩種肽色譜柱：A.VYDAC218TP52C1,5μm,2.1x250mmB.VYDAC218LTP5

5μm,2.1x250mm洗脫液：6mMTFA/4mMHFB11-95%ACN,0.25mL/min,75minAsp-蛋白質(zhì)消解物。不同的反相吸附劑在分別蛋白質(zhì)酶消化物中的肽碎片時(shí)可能表現(xiàn)出不同的選擇性。 用兩種RP-HPLC色譜柱分別β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片，結(jié)果說明：不同的相有時(shí)對(duì)肽的反相分別具有微小的影響〔圖10〕。與通常使用的C18色譜柱相比，C4柱的保存時(shí)間稍短，肽碎片洗脫圖形也有某些程度上的不同一有用的方法。有些試驗(yàn)室利用反相色譜柱的選擇性差異來進(jìn)展肽的二維分別。不同反相色譜柱對(duì)胰蛋白酶消化液的分別圖10.VYDAC218TP54(C214TP54(0-30%ACN+0.1%TF1.0mL/mi，18 460min樣品：βA的胰蛋白酶消化液。什么是聚合物鍵合？它又是怎樣影響肽的選擇性的？ 反相HPLC吸附劑一般通過把含有一個(gè)活性氯的氯硅烷烴鍵合到硅膠基質(zhì)上制成這些就形成了所謂的單體鍵合相它在硅膠基質(zhì)上有一個(gè)附著點(diǎn)也可以用具有多個(gè)活性氯的氯硅烷烴這就是所謂的聚合物鍵合相單個(gè)氯硅烷烴在相中交聯(lián)并在硅膠基質(zhì)上面形成硅氧烷聚合物同時(shí)附著多個(gè)疏水鏈雖然單體鍵合相與聚合物鍵合相的疏水性和分別特性相像但在分別肽時(shí)尤其是蛋白質(zhì)的酶消化物中的肽時(shí)它們會(huì)具有不同的選擇性這種不同的選擇性為色譜工作人員優(yōu)化蛋白質(zhì)消化物和其它肽的選擇性和分別度供給了更多的選擇空間圖11給出了用單體鍵合吸附劑和聚合物鍵合吸附劑分別一系列合成多肽的例子這些肽分別選擇性的明顯差異已經(jīng)標(biāo)出但同時(shí)也供給了進(jìn)展肽分別時(shí)對(duì)色譜柱的另一種選擇。單體鍵合與聚合物鍵合C

反相色譜柱對(duì)合成肽的分別18圖11.VYDAC218TP5238TP55μm,4.6x250mm)10-40%ACN+0.1%TF30mi。1.0mL/mi。合成聚合物吸附劑的作用HPLCpH和四周溫度的溫存條件下表現(xiàn)良好，但在極端條件H、高溫〕下，硅膠色譜柱的效果就會(huì)降低。合成聚合物〔比方比方聚苯〕能為多肽分別供給機(jī)械強(qiáng)度高的基質(zhì)。硅膠色譜柱在中度pHpH〔比方鹽酸胍12表示的是用合成對(duì)苛刻的條件下用合成聚合基質(zhì)進(jìn)展多肽分別成為可能。PS-DV3色譜柱對(duì)幾種肽的分別圖12.合成聚合物色譜柱〔聚苯乙〕色譜柱：VYDAC259VHP5415(PS-DVB,5μm4.6x150mm)130%ACN+0.1%TF15mi。1.0mL/min1234.1–85III6.val-4IIIpH13，在這個(gè)例子中，基于聚苯乙烯-二乙烯基苯的色譜柱可以用強(qiáng)堿〔1N氫氧化鈉〕和強(qiáng)酸〔1N硫酸〕進(jìn)展和分別度，這證明用強(qiáng)試劑清洗柱子并不會(huì)對(duì)色譜柱的性能產(chǎn)生負(fù)面影響。色譜柱用極值pH清洗前后對(duì)肽的分別狀況圖13.用強(qiáng)試劑清洗前〕1NNaO清洗后〕1硫酸清洗后〕，合成聚合物〔VYDAC259VHP5415(PS-DVB,5m,4.6x150mm)0.1%TFA，15min流速：1.0mL/min肽：123.III4.素5.神經(jīng)緊急素色譜柱尺寸：柱長(zhǎng)影響蛋白質(zhì)分別的吸附/脫附幾乎全部發(fā)生在色譜柱的頂端。因此，柱長(zhǎng)并不顯著影響蛋5-15cm長(zhǎng)柱子分別較好，15-25cmStone和Williams150mm〔80個(gè)峰和50mm〔65個(gè)峰250mm〔104個(gè)峰〕能從羧甲基轉(zhuǎn)鐵蛋白的胰蛋白酶消化物中分別出更多的肽碎片。柱長(zhǎng)對(duì)分別的其他方面也有影響。樣品容量樣品容量是色譜柱體積的函數(shù)。對(duì)等直徑的柱子而言，柱子越長(zhǎng)樣品容量越大。柱壓柱壓與柱長(zhǎng)成正比。當(dāng)用異丙醇等粘性更大的溶劑時(shí)，較短的柱子會(huì)產(chǎn)生較低的柱壓。柱子尺寸：直徑柱子直徑不影響峰分別，但影響進(jìn)樣、溶劑使用和檢測(cè)靈敏度。HL柱子直徑的減HPLC柱子尤其有用。分析1-200微克多肽樣品的分析柱標(biāo)準(zhǔn)直徑是4.6mm。較大直徑的色譜柱用于大量多肽的純化〔見40-48頁(yè)制備分別〕。近年來，小直徑柱子〔0.075mm到2.1mm〕的使用有所增加，由于小直徑柱子有以下優(yōu)點(diǎn)：削減溶劑用量用于毛細(xì)色譜柱和小孔色譜柱的流速為每分鐘幾微升〔見50頁(yè)附錄A〕。低流速能顯著削減多肽分別所需的溶劑量。增加檢測(cè)靈敏度低流速的小孔色譜柱洗脫多肽所需的溶劑體積較少。檢測(cè)器反響隨著流速的降低而增加。流速200mL/min的窄徑柱的靈敏度是流速1.0mL/min分析型色譜柱的六倍。能處理小量樣品檢測(cè)靈敏度增加意味著能檢測(cè)小量樣品RP-HPLC柱能分別和收集5納摩爾的胰蛋白酶消化產(chǎn)物。與質(zhì)譜接口HPLM阿摩爾級(jí)的單個(gè)樣品進(jìn)展常規(guī)檢測(cè)?！惨?8-31頁(yè)LC/MS〕。小直徑色譜柱的當(dāng)今趨勢(shì)窄徑柱內(nèi)徑2.1mm的微孔柱流速為100-300mL/min的試驗(yàn)室來說，微孔柱是一個(gè)有用的措施。大局部標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)都能在這些低流速下運(yùn)行，而很少需要或不需要修改。200mL/min左右的微孔柱與空氣關(guān)心質(zhì)譜有很好的接口。微孔柱和毛細(xì)柱雖然使用直徑1.0mm它們的HPLC系統(tǒng)需要修改，或用于該目的的特制儀器。進(jìn)展數(shù)據(jù)流分割后，毛細(xì)色譜柱能與電噴霧甚至納升電噴霧質(zhì)譜儀接口。Davis和Lee的在一篇論文中供給了用微孔柱和毛細(xì)管柱取得最正確性能的有價(jià)值的信息得使用小孔色譜柱的人閱讀。很多期刊都有關(guān)于質(zhì)譜與毛細(xì)管柱聯(lián)用的具體論文〔26-29頁(yè)〕。例子圖14表示的是用微孔柱〔內(nèi)徑1.0mm〕對(duì)血紅素的胰蛋白酶消化物的分別。用微孔柱〔1.0mm〕對(duì)血紅素的胰蛋白酶消化物的分別圖14.用微孔R(shí)P-HPLC色譜柱對(duì)血紅素的胰蛋白酶消化物的分別〔6〕色譜柱：C18,1.0x250mm(VYDAC218TP51) TFA水B為0.1%TFA乙腈溶液。圖15所示的是用內(nèi)徑75μm的毛細(xì)管柱對(duì)肌球素的胰蛋白酶消化物分別的例子。毛細(xì)管柱〔75μm〕對(duì)肌球素的胰蛋白酶消化物的分別圖15.毛細(xì)RP-HPLC色譜柱：C18(VYDAC218MS),75μm，毛細(xì)管柱流速：0.5μL/min水/TFA/乙腈的梯度洗脫。圖16表示的是用內(nèi)徑300μm的毛細(xì)管柱對(duì)3皮摩爾BSA的胰蛋白酶消化物的分別，承受質(zhì)譜檢測(cè)。毛細(xì)管RP-HPLC色譜柱對(duì)BSA胰蛋白酶消化物的分別圖16.30μmRP-HPLBS的胰蛋白酶消化物的分別。皮摩爾VYDAC218MS5.3055μm,300A,-C18反相柱(300μmx50mm流速：5μL/min.流淌相:A=0.198,2%CAB=0.1%98%ACN,23%0-3%漸變65mi50%70mi75%。檢測(cè)器：質(zhì)譜M〕?！?b基峰是指色譜圖中每次振幅最大時(shí)的單個(gè)質(zhì)譜峰?；宓纳V圖強(qiáng)調(diào)了含有單個(gè)主要分子的峰，消退了特別峰和噪聲。HPLC多肽分別中流淌相和溫度的作用把多肽從RP-HPLC柱子上脫附和洗脫下來用的是含有機(jī)調(diào)整劑和離子對(duì)溶劑或緩沖液的水pH〔溶劑梯度〕的方法。當(dāng)溶劑到達(dá)能引起脫附的濃度時(shí)，多肽就從色譜柱子上脫附并洗脫下來。有機(jī)調(diào)整劑有機(jī)試劑的作用是把多肽分子從疏水性的吸附表層脫附下來，漸漸上升有機(jī)溶劑的濃度〔梯度〕，直到多肽脫附并洗脫下來。乙腈〔ACN〕是最常用的有機(jī)調(diào)整劑，這是由于它：易揮發(fā)，簡(jiǎn)潔從收集的組分中除去；粘度低，柱壓??；短波幾乎無紫外〔UV〕吸?。唤?jīng)長(zhǎng)期使用證明，其在RP-HPLC多肽分別中牢靠。異丙醇異丙醇的粘度而保持其疏水性，我們建議使用乙腈：異丙醇為50:50的混合液。在有些狀況下，在乙腈中加1-3%的異丙醇能增加蛋白質(zhì)的回收率。乙醇RP-HPLCFDA等治理機(jī)構(gòu)所生疏。乙醇已用于洗脫疏水性的跨膜蛋白質(zhì)，也用于純化處理。甲醇或其它溶劑甲醇或其它溶劑與常用的溶劑相比沒有什么優(yōu)點(diǎn)，而且不用與多肽分別。洗脫梯度洗脫多肽幾乎總使用梯度溶劑。漸漸增加有機(jī)溶劑的濃度，能得到最銳利的峰和最好的分別度。0.5-1%。像每分鐘0.05-0.1%1〔見第2頁(yè)中胰島素變異物的分別所用的梯度斜率每分鐘只有0.25%。圖17說明，對(duì)蛋白質(zhì)來說，削減梯度的斜率通常能提高分別度。承受低梯度時(shí)酶亞基分別度提高圖17.色譜柱：C18(VYDAC218TP104)流速：1mL/min25%到50%ACN的TFA水溶液。樣品：C21。3-595%。有機(jī)濃度過高會(huì)洗去全部有機(jī)相上的水，也會(huì)使柱平衡更加困難。梯度斜率對(duì)肽選擇性的影響由于有些肽和反相柱子外表發(fā)生作用的方式有微小的差異，所以溶劑梯度的斜率可能會(huì)影響肽的選擇性，由此影響肽之間的分別度。說明這種影響。圖18中是在三種不同的梯度斜率〔時(shí)間〕，對(duì)人生長(zhǎng)激素的胰蛋白酶消化物一些碎片的分別。隨著斜率的降低，碎片9和10的表現(xiàn)和預(yù)期的一樣，即分別度隨著梯度斜率的降低〔梯度時(shí)間增加〕11和12表現(xiàn)不同。分別度隨著梯度斜率的降肽對(duì)的影響，當(dāng)溫存地轉(zhuǎn)變梯度斜率時(shí)，要對(duì)這種影響進(jìn)展監(jiān)控。不同梯度時(shí)間肽的分別圖18.〔坡度C18,150x4.6mm1mL/minA.45minB.115minC.180mi60%ACN+0.1%TF水溶液9、10、11、12、1338。離子對(duì)試劑和緩沖液離子對(duì)試劑或緩沖液調(diào)整洗脫pH值，并與多肽作用，從而加強(qiáng)分別。三氟乙酸應(yīng)用最廣的離子對(duì)試劑是三氟乙酸〔TFA〕，其應(yīng)用廣泛的緣由是：易揮發(fā)，易于從收集組分中分別；短波段幾乎無紫外〔UV〕吸?。唤?jīng)長(zhǎng)期使用證明，其在RP-HPLC多肽分別中牢靠。TFA通常使用的濃度為0.1%〔w/v〕左右。0.5%的TFA濃度用來溶解更大分子的或更疏水的蛋白質(zhì)；低濃度的TFA則間或用于胰蛋白酶消化物的分別。雖然進(jìn)展的色譜柱允許使用更低濃度的TFA，但當(dāng)TFA濃度低于0.1%時(shí)，蛋白質(zhì)的色譜圖峰形會(huì)退化〔見28頁(yè)〕。假設(shè)用TFA濃度不變的洗脫梯度，當(dāng)在210-220nm檢測(cè)時(shí)，有時(shí)會(huì)消滅基線漂移。水溶劑到非水溶劑的介電常數(shù)的變化會(huì)影響π–π190-250nmTFA光譜吸取造215nm，并在B液中比A液少加15%的TFA以補(bǔ)償基線漂移。比方，A液中用0.1%的TFA，B液中用0.085%的TFA。使用質(zhì)量好的和小量的TFATFA圖中會(huì)消滅假峰〔見附錄B〕。TFA濃度對(duì)選擇性的影響三氟乙酸的濃度會(huì)影響特定肽對(duì)的選擇性或分別度。雖然流淌相中TFA的濃度通常在0.05-0.1%之間，但轉(zhuǎn)變TFA的濃度也會(huì)對(duì)肽的選擇性產(chǎn)生微小的影響，見圖19。這就意味著，要得到好的重現(xiàn)性，在肽分別方法中，慎重把握TFA的轉(zhuǎn)變TFA的濃度，能進(jìn)一步優(yōu)化肽對(duì)之間的分別度。TFA濃度對(duì)肽選擇性的影響圖19.TFA色譜柱：C18(VYDAC218TP54)流速：1mL/min洗脫液：TFA0-50%CAN，濃度如以下圖。樣品：注：圖中顯示的是色譜圖的一局部。雖然TFATFA的分別中〔圖20〕，有些肽用磷酸鹽得到了比用TFA更尖的峰，使催產(chǎn)素與緩激肽的洗脫挨次TFATFA洗脫得早，由于TFA與緩激肽中的兩個(gè)TFA分別時(shí)隱蔽著的兩個(gè)小雜質(zhì)，在用磷酸鹽分別時(shí)顯現(xiàn)出來了〔20。鹽酸也顛倒了催產(chǎn)素與緩激肽的洗脫挨次，并分別出TF時(shí)看不見的雜質(zhì)〔20。肽分別時(shí)TFA及替代性離子配對(duì)試劑/緩沖液的比較圖20.218TP54C.5mMHCl,pH2.0肽：123II45.I。七氟丁酸〔HFBA〕能有效地分別堿性蛋白質(zhì)，三乙胺磷酸鹽〔TEAP〕已用于制備分別。有TEAP比用TFA10-60％濃度的甲酸已用于格外疏水性多肽的色譜分析。甲酸也用于肽的LC/MS分別，由于TFA被證明在肽的LC/MS中很有效〔見26-29頁(yè)關(guān)于LC/MS的具體爭(zhēng)論〕。Guo及其同事比較了TFA,HFBA和磷酸在肽洗脫中的使用，覺察它們都有不同程度的選擇性。pH對(duì)肽分別的影響pH21所示。pH4.4時(shí)〔圖21B〕五種肽都比在pH2.0時(shí)〔圖21A〕洗脫得早，肽的保存時(shí)間也相對(duì)發(fā)pH2.0pH4.4時(shí)同時(shí)洗脫。pH6.5時(shí)〔圖21C〕肽的保存時(shí)間比在pH4.4時(shí)要長(zhǎng)，但洗脫挨次有很大不同，血管緊急素II,在pH2.0-4.4pH工具。合成聚合物反相材料將實(shí)際pH的范圍擴(kuò)大到將近pH14〔見13頁(yè)的圖13〕。如圖22所示，肽在高pH值時(shí)與低pHpH值從2變到9明顯的轉(zhuǎn)變。pH圖21.用磷酸鹽作緩沖液，pH在2.0、4.4、6.5時(shí)五種肽的洗脫。VYDAC218TP54,pH2.0B.20mM,pH6.5肽：1.23.II45.血管緊急素I.用HPLC從蛋白質(zhì)消化物中分別肽碎片的操作條件0.1%TEA作為李子配對(duì)試劑，但用別的離子配對(duì)試劑或H有時(shí)能得到更好的分別度。TFA廣泛用作離子配對(duì)試劑，也是肽分別的最好起始點(diǎn)。但是也要考慮使用磷酸鹽或鹽酸等緩沖液，或爭(zhēng)論pH的影響，以優(yōu)化肽的分別。為了測(cè)試pH的影響，配制100mM磷酸鹽溶液〔pH約4.4〕。取三分之一用磷酸調(diào)整到pH2.0，三分之一用NaOH調(diào)整到pH6.5。然后稀釋每份溶液至10-20mM用作洗脫緩沖液。用TFA測(cè)肽的分別度，這三份磷酸鹽緩沖液〔pH2.0，pH4.4，pH6.5〕和鹽酸都是為了實(shí)現(xiàn)良好的肽分別而查找最優(yōu)試劑和pH條件的很好的方法。合成聚合物〔聚苯乙烯-二乙烯苯基〕色譜柱在低和高pH時(shí)對(duì)肽的分別TFApH2.B.15mMNaOH,pH9.流速：1.0mL/min肽：1234.神經(jīng)緊急素1-85.血管緊急素III.6.val-4III流淌相流速流速對(duì)多肽分別沒有什么影響。流速不影響多肽從反相外表脫附和之后的保存時(shí)間。流淌相流速的影響。洗脫流速會(huì)影響小肽的分別度，這是由于小肽在RP-HPLC色譜柱上的行為介于蛋白質(zhì)和小分子之間〔見第4頁(yè)〕。Stone和Williams覺察，從羧甲基轉(zhuǎn)鐵蛋白的胰蛋白酶消化物中分別出的肽碎片的數(shù)量取決于洗脫流速。在分析型HPLC色譜柱上，流速0.2mL/min時(shí)，只分別出不到800.8mL/min時(shí)能分別出1160.5-1.0mL/min之間，分別出的肽碎片數(shù)量沒有什么變化。度微小的提高。流速也會(huì)影響分別的其它方面，比方：檢測(cè)靈敏度低流速只能洗脫小量的多肽，吸附與敏感度也因此增加。HPLC窄徑色譜柱能提高檢測(cè)靈明度，這主要是由于它能在低流速下運(yùn)行，洗脫多肽所用溶劑的量也很小。樣品溶解性高流速能提高熟水性多肽的溶解性，雖然這樣也會(huì)增加純化該樣品的溶劑用量。柱壓柱壓與流速有直接的關(guān)系。流速越大，柱壓越高。梯度流速的變化會(huì)影響梯度斜率與峰形調(diào)整流速會(huì)轉(zhuǎn)變其對(duì)梯度斜率的影響而轉(zhuǎn)變分別度。溫度對(duì)肽分別的影響柱溫會(huì)影響溶劑粘度，柱壓和保存時(shí)間，也會(huì)影響肽的選擇性。肽做色譜時(shí)溫度是一個(gè)重要的分別參數(shù)。在每個(gè)HPLC方法中，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化溫度分別多肽。如圖2320oC時(shí)，碎片11、12、13幾乎13的保存值比碎片11、12要長(zhǎng)，所以40oC時(shí)這三者的分別度很好。但60oC時(shí)，碎片11和12同時(shí)洗脫，說明白隨溫度上升，選擇性的變化。在20oC時(shí)，碎片15比碎片10洗脫得早，40oC時(shí)它們幾乎同時(shí)洗脫，60oC時(shí)碎片10首先洗脫，兩者得到很好的分別。這些結(jié)果說明白溫度對(duì)肽選擇性的重要影響。溫度對(duì)肽分別的影響圖23.C18,4.6x150mm1mL/min.梯度漸變60%CAN+1%TFmin。溫度：如以下圖樣品：39。第八章用HPLC純化和分別多肽RP-HPLC50mm或更大的色譜柱用于純化克級(jí)量的用于臨床試驗(yàn)或商業(yè)藥品的重組蛋白質(zhì)〔見附錄A、以及優(yōu)化洗脫梯度。液的變化、不同離子配對(duì)試劑或緩沖液的使用、以及梯度條件的變化?；?，這些大尺寸柱子和試驗(yàn)室規(guī)模常規(guī)分別所用柱子的分別特性幾乎一樣。分別材料的選擇產(chǎn)程規(guī)模反相分別的材料能得到和分析型反相色譜柱幾乎一樣的分別特性。VYDAC300A的硅膠微粒大小從不到5微米到幾乎30微米不等〔圖4510VYDACTP-300A孔徑硅膠的粒度分布40.530析規(guī)模材料具有幾乎一樣的蛋白質(zhì)和肽選擇特性，它的加工工藝與分析型大小的硅膠一樣，51015-20蛋白質(zhì)就說明白這一點(diǎn)〔圖41。三種柱子的蛋白質(zhì)選擇性和保存時(shí)間是一樣的。不同微粒——10-15、15-20或20-30μm——通常用于大規(guī)模純化，由于它們比小分子材料廉價(jià)，產(chǎn)以得到最大樣品通量〔見43頁(yè)。當(dāng)色譜柱“超載負(fù)”時(shí)，大微粒材料和小微粒材料的性能42510的峰寬和分別度要好很多2-3倍峰寬只比用較大微粒材料的大20-50%左右。柱子超載負(fù)時(shí)，小微粒略微的分別度的優(yōu)勢(shì)并不能彌補(bǔ)其本錢高、柱壓高以及在工藝應(yīng)用中的實(shí)際困難。不同粒度RP-HPLC色譜柱的蛋白質(zhì)分別圖41.不同粒度反相材料的蛋白質(zhì)選擇性一樣，它們之間唯一的區(qū)分在于，隨著粒度的增加，峰寬增大，色譜柱材料：A.VYDAC214TP,5μm 214TP,10μmC.VYDAC214TP,15-20μm流動(dòng)相：24-95%ACN+0.1%TFA，1.5mL/min，30min放大洗脫條件特性。洗脫溶劑試驗(yàn)室規(guī)模的純化通常使用和分析型色譜一樣的有機(jī)調(diào)整劑，即乙腈。離子對(duì)試劑或緩沖液試驗(yàn)室規(guī)模的純化通常使用和分析型色譜一樣的離子對(duì)試劑或緩沖液。梯度特性22mm4.6mm23〔224.6，平方1.0mL/min3030mL。要把該方法應(yīng)用22mm23690mL23延長(zhǎng)梯度時(shí)間，流速也會(huì)局部地增加。比方，流速為23mL/min30分鐘，梯度體積為690mL10mL/min69常設(shè)置得更低——即單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)調(diào)整劑濃度增加較小——以增加分別度要多肽時(shí)。不同粒度RP-HPLC材料的蛋白質(zhì)進(jìn)樣量圖42.雖然低進(jìn)樣量時(shí)小粒度材料的峰寬很窄，但承受高進(jìn)樣量即色譜柱“超載負(fù)”時(shí)，峰寬仍沒太大變色譜柱材料VYDAC214TP,5μmVYDAC214TP,10μmVYDAC14TP,1520μmVYDAC(R)214TP,2030μm洗脫液：24-95%CAN+0.1%TFA水溶液，1.5mL/min，30min核糖核酸酶過程放大純化：多于五克的肽洗脫劑等溶劑在過程色譜時(shí)更適用一些。乙醇相對(duì)來說無毒、與水混合時(shí)不易燃、本錢低并被FDA等治理機(jī)構(gòu)所生疏。乙醇目前用于大規(guī)模過程純化。離子配對(duì)試劑或緩沖液通常用于分析型色譜的離子對(duì)試劑不太適用于過程放大色譜子配對(duì)試劑或緩沖液包括乙酸〔〕種生物技術(shù)多肽治療劑的分別。梯度特性依據(jù)大柱子而放大洗脫梯度的試驗(yàn)室規(guī)模純化能用于過程放大純化〔見上用梯度通常都很小。一針色譜分析中能純化多少肽？假設(shè)RP-HPLC分別的目的是收集純化的多肽以備進(jìn)一步使用衡以下三個(gè)因素：通量給定時(shí)間內(nèi)純化的多肽量。雖然低載負(fù)產(chǎn)生最大的分別度，但每針色譜分析時(shí)純化量較少，通量也較低。純度純度用最終純化產(chǎn)物的重量占總重量的百分?jǐn)?shù)來表示到，雖然這會(huì)限制柱子能載負(fù)的樣品量。產(chǎn)量大局部多肽。假設(shè)分別度較低，則收集峰的中間局部，這樣就削減了產(chǎn)量。RP-HPLC最正確分別度時(shí)的載負(fù)容量；實(shí)際樣品載負(fù)量柱子允許載負(fù)的最大多肽量。最正確分別度時(shí)樣品載負(fù)力氣0%的分析物最大量。對(duì)大多數(shù)多肽來說，分析柱〔直徑4.6mm〕在到達(dá)“超載負(fù)”點(diǎn)前，峰寬和分別度保持不變的樣品量在100到20μg〔圖4。度降低。核糖核酸酶在分析色譜柱上的進(jìn)樣曲線43.進(jìn)樣量直到200μg200μg實(shí)際進(jìn)樣范圍是200-5000μg。色譜柱：VYDAC214TP54(C4,5μm,4.6x250mm)洗脫液：24-95%ACN+0.1%TFA，30min樣品：核糖核酸酶實(shí)際樣品載負(fù)量樣量多于最正確分別度定義的樣品量。隨著樣品載負(fù)增加，多肽的峰寬也隨之增加〔圖43和4，但峰形仍保持對(duì)稱。這就允許樣品載負(fù)量可以是定義樣品量的10到50倍，而仍能保持可承受的分別度。4425、100、200、500100025100μg〔在最正確分別度的范圍內(nèi)〔圖44A,100g“超載負(fù)”點(diǎn)〕20g進(jìn)樣量時(shí)，峰寬明顯增加，導(dǎo)致分別度降低〔圖4450g時(shí)，分別度顯著降低〔圖441000g時(shí)，雜質(zhì)峰與核糖核酸酶的峰完全重合〔圖44。進(jìn)樣量對(duì)蛋白質(zhì)峰形和分別度的影響44.A.每種蛋白質(zhì)25μgB.每種蛋白質(zhì)100μgC.每種蛋白質(zhì)200μgD.每種蛋白質(zhì)500μgE.每種蛋白質(zhì)100μgYDAC214TP54(C4,5μm,4.6x250mm25-50%CAN+0.1%mL/min，25min樣品：核糖核酸酶和溶菌酶200μg時(shí)仍保持不變，但之后分別度就漸漸削減了。在50μg時(shí)〔圖44100g時(shí)〔圖44，雜質(zhì)峰和溶解酵素峰就完全重合了。蛋白質(zhì)和雜質(zhì)峰可以通過運(yùn)行一個(gè)更小的梯度提高分別度。由于核糖核酸酶和溶解酵素的分別度甚至在1000μg5x30cm1.25x25cm5多肽最大結(jié)合量多肽在反相色譜柱上的最大結(jié)合量取決于多肽的大小和性質(zhì)材料10mg肽——在4.6x250mm色譜柱上結(jié)合25mg。較高的肽結(jié)合量為每克分別材料10-20mg雖然接近色譜柱最大結(jié)合量的樣品量分別度很小通量和分別度的優(yōu)化方法樣品濃度樣品的濃度會(huì)影響相鄰洗脫的多肽的分別度建議使用小梯度相鄰洗脫的多肽之間可以通過使