腎康丸對糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞形態(tài)及dupr表達的影響

腎康丸對糖尿病腎病大鼠腎小球足細胞形態(tài)及dupr表達的影響

糖尿病性腎炎（dn）是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，發(fā)病率高，治療方法復雜，治療效果差。通常進行于端頭期，并對疾病產(chǎn)生重大影響。近年來的研究表明，腎衰竭是dn持續(xù)發(fā)展的關鍵。足細胞破裂和愈合性皮炎是選擇腎功能過濾障礙的關鍵之一。德明可以用作光顯微鏡下足細胞損傷的指標。目前DN的西醫(yī)治療措施除飲食治療、控制血糖等之外,以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑的應用最為廣泛和重要,但這些方法臨床療效均相當有限,迄今尚無針對DN的特異性西藥。中醫(yī)藥在DN的治療方面具有比較明顯的優(yōu)勢,但絕大多數(shù)尚處于療效觀察和經(jīng)驗積累階段,目前國內(nèi)外未見對DN具有確切療效的中藥新藥問世。我們在對DN的長期臨床治療和研究過程中,精心篩選提煉藥物組方,命名為腎康丸,經(jīng)反復臨床驗證,療效十分確切,并已獲得國家發(fā)明專利(專利號200610036515.2)。本研究旨在通過觀察DN模型大鼠足細胞形態(tài)改變及desmin、podocin表達的變化,探討腎康丸對DN的腎保護作用機制。1材料和方法1.1藥品、制劑及菌株雄性SD大鼠56只,體質(zhì)量180~230g,購自中山大學實驗動物中心。腎康丸(由黃芪、水蛭、金櫻子、益母草等組成),南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院藥劑科生產(chǎn),制劑號20031214。厄貝沙坦片(安博維),杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn),批號(2000)J-24。鏈脲佐菌素(STZ,Sigma)、酶聯(lián)免疫吸附測試大鼠尿微量白蛋白試劑盒、24h尿蛋白定量試劑盒(廣州威佳科技有限公司)、兔抗desmin抗體、兔抗podocin抗體(Boster)、抗體稀釋液(DAKO)、Envision免疫組化試劑盒(廣州基因有限公司)。1.2方法1.2.1大鼠dn模型及分組所有動物適應性喂養(yǎng)1周后,禁食12h,空腹狀態(tài)下、STZ按55mg/kg一次性腹腔注射,STZ臨用前用枸櫞酸鈉緩沖液(0.1mol/L,pH4.5)配制。另設正常對照組(n=8),注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。全部大鼠標準飲食喂養(yǎng),不使用胰島素及其他降糖藥物。72h后開始監(jiān)測空腹血糖、尿糖、尿量、24h尿微量白蛋白排泄率的變化,若連續(xù)3次達到下列標準者,即認為DN模型建立:(1)空腹血糖>16.6mmol/L;(2)尿糖強陽性;(3)尿量>原尿量150%;(4)24h尿微量白蛋白排泄率>30mg/24h。大鼠造模成功后,隨機分為4組(n=12):DN模型對照組、腎康丸組、厄貝沙坦組、腎康丸和厄貝沙坦合用組。腎康丸、厄貝沙坦分別按3000mg/(kg.d)、50mg/(kg.d)每日分2次灌服[按照人與大鼠體表面積換算,分別相當于成人300mg/(kg·d)、5mg/(kg·d)],連續(xù)8周。對照組灌服等量生理鹽水。1.2.2大鼠的消毒處理實驗結束前1d代謝籠收集24h尿液,計24h尿量。大鼠處死前稱質(zhì)量;以0.3%戊巴比妥鈉按35mg/kg質(zhì)量的劑量腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,分離血清,-20℃保存;取雙側腎臟,稱重后液氮凍藏。1.2.324小時尿微白試驗1.2.424小時尿蛋白試驗1.2.5甲苯磺酸鹽的染色大體標本觀察。光鏡觀察:腎組織經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定,梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片后,HE、PAS、Masson三色染色觀察。取約1mm3的腎皮質(zhì)組織塊,經(jīng)2.5%戊二醛固定、1%餓酸后固定、脫水、環(huán)氧樹脂618包埋,超薄切片后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色,JEM1010透射電鏡下觀察。1.2.6成全性過氧化物酶模型采用二步法,5μm腎組織石蠟切片梯度脫蠟水化后,3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶,PBS緩沖液(0.01mol/L,pH7.4)洗滌,正常兔血清封閉,依次加入desmin抗體、EnVision標記二抗,DAB顯色,蘇木精復染,樹脂封片。相同方法檢測podocin的表達。1.2.7小鼠小鼠血清中etmin的表達情況采用JD-801計算機圖像分析系統(tǒng),每組隨機取8張切片,在每張切片上隨機選取10個腎小球,計算每個腎小球內(nèi)陽性信號面積與腎小球面積的比值,取其平均值作為該實驗動物的指標值,計算各組腎小球內(nèi)desmin的陽性信號面積百分比。相同方法計算podocin的陽性信號面積百分比。1.2.8統(tǒng)計方法觀察指標以均數(shù)±標準差表示,采用方差分析,用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。2結果2.12腎康丸對24h尿蛋白定量的影響DN模型對照組大鼠24h尿蛋白定量明顯高于正常對照組(P<0.01)。與DN模型對照組比較,腎康丸組、厄貝沙坦組24h尿蛋白定量均明顯減少(P<0.05),兩藥合用組減少更明顯(P<0.01);與腎康丸組、厄貝沙坦組比較,兩藥合用組24h尿蛋白定量亦明顯減少(P<0.05);腎康丸組、厄貝沙坦組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。2.2透射電鏡檢測足突部分融合DN模型對照組大鼠處死前可見大量腹水;腎臟外觀蒼白、腫脹、質(zhì)地變硬;HE、PAS和Masson三色染色,光鏡下可見腎小管大量蛋白管型,腎小管上皮細胞脫落、空泡變性,腎間質(zhì)炎性細胞浸潤,腎小球輕度系膜增生、基底膜未見明顯異常;透射電鏡顯示足突部分融合,足細胞腫脹、破裂、溶解。經(jīng)藥物干預后各組上述病理變化均明顯減輕,尤以兩藥合用組變化更為顯著(圖1,2)。2.3腎康丸對腎貝沙坦組小鼠肝腎7d陽性面積年齡的影響Desmin可大量表達于足細胞內(nèi)。通過油鏡放大觀察,模型對照組足細胞desmin陽性顯色明顯,經(jīng)藥物干預后各組陽性顯色均明顯減少,尤以兩藥合用組變化更為顯著(圖3)。半定量分析顯示:與DN模型對照組比較,腎康丸組、厄貝沙坦組腎小球desmin陽性面積百分比均有顯著性差異(P<0.05),兩藥合用組顯著性差異更明顯(P<0.01);與腎康丸組、厄貝沙坦組比較,兩藥合用組陽性面積百分比亦有顯著性差異(P<0.05);腎康丸組、厄貝沙坦組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05,圖3,4)。2.4podocin的表達使用免疫組化染色定位分析,podocin局限性分布于腎小球,在小管和間質(zhì)未見分布,各組間podocin的分布未見明顯差異。半定量分析顯示:podocin的表達在正常對照組最高,模型對照組最低(P<0.01),經(jīng)藥物干預后各組陽性顯色均明顯增加,但仍然低于正常對照組(P<0.01);與DN模型對照組比較,腎康丸組、厄貝沙坦組、兩藥合用組腎小球podocin陽性面積百分比均有顯著性差異(P<0.01);3個治療組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05,圖5,6)。3腎康丸對dn的保護作用Podocin是由定位于1q25-31的NPHS2基因編碼、表達于SD上的一種整合膜蛋白,NPHS2基因突變可導致常染色隱性遺傳性類固醇抵抗型腎病綜合征,podocin缺失的小鼠可出現(xiàn)嚴重的蛋白尿、腎功能損傷及腎小球足突的廣泛融合。目前,關于podocin在DN中的變化及作用機制的研究報道較少,且結果不一。Menne等發(fā)現(xiàn)DN時podocin的表達無顯著性改變;Awad等則發(fā)現(xiàn)DN時podocinmRNA與蛋白的表達均出現(xiàn)顯著下調(diào)。本實驗中我們發(fā)現(xiàn),STZ誘導的DN大鼠模型腎組織podocin的表達出現(xiàn)顯著下調(diào);應用腎康丸、厄貝沙坦干預后,腎組織podocin的表達均顯著增加。本實驗結果表明,通過上調(diào)足細胞podocin的表達,使podocin蛋白的合成增加,從而維持SD形態(tài)的完整和濾過功能的正常,可能是腎康丸對DN的腎保護作用機制之一。按照試劑盒說明書,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。按照試劑盒說明書,采用Bradford法檢測。歷代醫(yī)家對DN的病機認識盡管有所不同,但多數(shù)認為乃肺、脾、腎三臟虧虛而致,陰虛為本、燥熱為標是其基本病機,并貫穿于疾病發(fā)生、發(fā)展的全過程。我們認為,DN患者久病多耗氣傷陰,累及脾腎,導致脾腎虧虛,氣陰兩傷。氣虛血行無力,病久入絡,易致血行瘀滯,故多兼夾瘀血阻絡之證。脾虛清陽不升,失于健運,水谷精微之氣無以化生。腎虛固攝無權,精微持續(xù)下注,失于流暢而外泄,則可出現(xiàn)蛋白尿。因此,治療上以益氣健脾、滋腎養(yǎng)陰兼活血通絡為法。腎康丸組方中,黃芪益氣健脾,斂精降糖;金櫻子滋陰補腎,滋而不膩;益母草、水蛭活血通絡,起標本兼治之功。我們應用腎康丸治療糖尿病腎病7年余,腎康丸制成本院自制制劑用于臨床亦已3年余,經(jīng)反復臨床驗證,療效十分確切,能顯著減少蛋白尿,改善患者一般情況,有效地延緩DN的進展,且價格便宜,可明顯減輕病人的經(jīng)濟負擔,也適合病人長期服用。近年的研究發(fā)現(xiàn),足細胞損傷是導致DN持續(xù)進展的關鍵。糖尿病時,高血糖、高血壓等多種因素可通過細胞因子、活性氧基團、及改變血流動力學等導致足細胞脫落或發(fā)生凋亡。足細胞數(shù)目減少和腎小球基底膜的裸露導致腎小球組織形態(tài)學的一系列變化,從而引起尿蛋白的產(chǎn)生,加速腎損害進程;另一方面其自身也可表型轉(zhuǎn)化為成纖維樣細胞,直接或通過產(chǎn)生某些促細胞外基質(zhì)生長因子,促使ECM聚積,導致DN的形成與發(fā)展,最終促發(fā)和加速腎小球硬化和終末期腎臟病的進程。desmin可作為光鏡下足細胞損傷的標志。Blanco等發(fā)現(xiàn)2型DN模型大鼠第16、24、32周腎小球內(nèi)desmin表達均顯著增加;覃喬靜等應用Wistar大鼠按STZ60mg/kg一次性腹腔注射建立糖尿病模型,5周后發(fā)現(xiàn)大鼠腎小球內(nèi)desmin表達顯著增