堿性亞硫酸鹽預處理桉木原料的研究

堿性亞硫酸鹽預處理桉木原料的研究

木質(zhì)素資源是植物通過光合作用產(chǎn)生的有機資源，主要由三種高度組成的高科技材料組成，如樹木、農(nóng)業(yè)和食品。隨著世界上最豐富的碳氫化合物資源的匱乏，人類生物福利的利用生物技術(shù)的普及對提高木生動物的生物化學具有重要意義。通過酶水解，我們可以將木生動物的纖維和半素轉(zhuǎn)化為單糖、低聚糖、苯甲酸和其他附加費產(chǎn)品，從而提高其利用率。這是目前生物科學領(lǐng)域的研究熱點。然而，由于天然纖維表面對生物酶的抗逆性，直接酶處理的效率低，因此需要進行一定的預處理，以提高表面與酶的結(jié)合。目前，最常用的預處理方法是堿級甲環(huán)酸鹽預處理、熱提取、蒸汽爆炸預處理、稀酸預處理、氨水和有機溶劑預處理。其中，堿性硫酸鈉預處理對其他預處理具有一定的優(yōu)勢：（1）與酸性預處理相比，對設(shè)備的腐蝕性預處理相比較少，并且在預處理過程中不存在對硝胺等發(fā)酵抑制劑的影響；（2）在堿性堿性硫酸鹽預處理過程中，木質(zhì)素的部分磺化可以改善纖維素和親水性纖維素的結(jié)合，提高后續(xù)纖維素酶的酶分解效率?；谏鲜鲈颍疚囊澡駱錇樵?，采用堿性堿性硫酸鹽預處理，研究了預處理前后樣品的成分和結(jié)構(gòu)，通過其他酶分解實驗研究了這種預處理方法對酶分解和糖化的促進作用。1實驗1.1纖維原料的制備實驗所用桉木木片由福建龍巖某廠提供,木片經(jīng)植物粉碎機粉碎后,取40～60目木粉備用.實驗所用纖維素酶由杰能科公司提供,其主要成分為木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,采用DNS法測得其酶活為140FPU/mL.1.2采用gmn-400型高濃磨漿原料經(jīng)風干后在電加熱回轉(zhuǎn)式蒸煮鍋中進行堿性亞硫酸鹽預處理.預處理具體條件為:固(質(zhì)量,g)液(體積,mL)比1∶3,NaOH用量3%(質(zhì)量分數(shù),以絕干桉木粉質(zhì)量為基準計,下同),Na2SO3用量12%,60min從室溫升至170℃,保溫時間2h.預處理結(jié)束后,采用天津輕工機械廠生產(chǎn)的GNM-300型高濃磨漿機進行分段磨漿,其中一段磨盤間隙0.4mm,二段盤磨間隙0.1mm.1.3酶解液的糖含量及酶解渣的活性精確稱取桉木木粉及預處理后漿料各8g(絕干),在恒溫振蕩器內(nèi)進行纖維素酶酶解.酶解條件:溫度50℃,酶用量40FPU/g(以每克固體漿料計),固液比1∶20,酶解時間60h,乙酸-乙酸鈉緩沖液pH4.8.酶解完成后,離心取其上清液用戴安公司生產(chǎn)的DionexICS-3000型高效陰離子交換色譜(CarboPACTMPA1陰離子交換柱,ED檢測器,柱溫30℃,流速0.650mL/min)分析酶解液中的單糖含量.酶解葡萄糖(木糖)轉(zhuǎn)化率按下式計算:葡萄糖(木糖)轉(zhuǎn)化率=V酶×ρ糖m漿W1×1000×0.95Q1×100%,式中:0.95為轉(zhuǎn)化率校正系數(shù);V酶為酶解液的體積,mL;ρ糖為酶解液中葡萄糖(木糖)含量,mg/mL;m漿為預處理后用于酶解的漿料質(zhì)量,g;W1為預處理后漿料得率,g/g;Q1為原料中葡萄糖(木糖)含量,%.酶解殘渣經(jīng)冷凍干燥后,再用72%硫酸法測其殘留的糖組分和木質(zhì)素含量.酶解殘渣中木質(zhì)素轉(zhuǎn)化率按下式計算:木質(zhì)素轉(zhuǎn)化率=m渣×W2m漿W1×Q2×100%,式中:m渣為酶解殘渣質(zhì)量,g;W2為酶解殘渣中木質(zhì)素含量,%;Q2為原料中木質(zhì)素含量,%.1.4分析與表現(xiàn)1.4.1ft-ir分析采用KBr(光譜純)鹽壓片法在美國ThermoNicolet公司Nexus系列FT-IR紅外光譜儀上測定預處理前后的樣品及酶解殘渣的FT-IR譜圖,掃描范圍為400～4000cm-1.1.4.2纖維素及半纖維素含量的測定纖維素含量的測定采用硝酸-乙醇法,木質(zhì)素含量的測定采用72%硫酸法,綜纖維素含量的測定采用次氯酸鈉-乙酸法,半纖維素含量為綜纖維素含量與纖維素含量之差.1.4.3電鏡分析采用JSM-5500LV型掃描電子顯微鏡對預處理前后的樣品及酶解殘渣進行分析,觀察其內(nèi)部纖維素的結(jié)構(gòu)變化.1.4.4結(jié)晶度的計算在德國Bruker公司生產(chǎn)的XRD-6000型X射線衍射儀上測定預處理前后的樣品及酶解殘渣的結(jié)晶度.Cu靶,掃描范圍5°～80°.根據(jù)Segal公式計算相對結(jié)晶度:Cr=(I002-Iam)/I002×100%,式中,Cr為相對結(jié)晶度,I002為002面衍射峰的極大強度,Iam為衍射角為18°時非結(jié)晶背景的散射強度.2結(jié)果與討論2.1桉木糖和木糖營養(yǎng)成分比較采用72%硫酸法,測得桉木原料中各單糖及木質(zhì)素含量如表1所示.由表1可見,桉木原料中的糖組分主要是葡萄糖和木糖,除此之外,含有少量的半乳糖和阿拉伯糖,未檢測到甘露糖.桉木半纖維素中,木糖是主要成分,其含量約占半纖維素的70%.相對于草類植物,桉木的Klason木素含量較高,這與YuQiang等的研究一致.除碳水化合物和Klason木素外,桉木原料中還含有少量的酸溶木質(zhì)素、抽出物和灰分等其他組分.2.2預處理前后樣品和酶分解渣的分析與表現(xiàn)2.2.1半纖維素在預處理過程中的吸收強度桉木原料、預處理樣及酶解殘渣的紅外光譜見圖1.由圖1可見,桉木原料在1740cm-1處有一個明顯的吸收峰,該吸收峰為木質(zhì)纖維原料中半纖維素木聚糖的特征峰;經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,此峰消失,說明半纖維素在預處理中發(fā)生脫乙?；饔?半纖維素由于自身的非結(jié)晶態(tài)和低聚合度很容易受到破壞而降解.在桉木原料的紅外光譜中,898cm-1處的吸收峰為β-D-葡萄糖苷的特征峰,經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,該峰吸收強度基本不變,說明預處理過程對纖維素的降解較少,酶解殘渣在898cm-1處的吸收強度明顯減弱,說明大部分纖維素在酶解過程中被轉(zhuǎn)化成糖,殘渣中所殘留的纖維素較少.從1510和1600cm-1處的峰值來看,經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,其吸收強度略有減小,說明木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)在預處理過程中受到一定的破壞.2.2.2纖維素、半纖維素與半纖維素變化情況桉木原料、預處理樣及酶解殘渣的化學成分見表2.由表2可見,經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,桉木半纖維素的含量及木質(zhì)素含量均降低,而纖維素的含量卻由43.58%升高到58.05%.這說明,預處理過程中主要是半纖維素和木質(zhì)素降解,纖維素在預處理過程中基本不受影響,這與前面紅外分析的結(jié)果一致.桉木堿性亞硫酸鹽預處理過程中,木質(zhì)素的降解使得纖維素、半纖維素被極大程度地暴露出來,從而更易與酶接觸,提高后續(xù)酶解糖的轉(zhuǎn)化率,但半纖維素的降解則會降低酶解糖的轉(zhuǎn)化.對酶解殘渣的進一步分析發(fā)現(xiàn),其木質(zhì)素含量高達65.91%,除此之外,還含有一定量的酸溶木質(zhì)素、抽出物和灰分等其它組分,纖維素和半纖維素的殘留則相對較小.2.2.3纖維整整無損桉木原料、預處理樣及酶解殘渣的掃描電鏡分析結(jié)果見圖2.由圖2可見,未經(jīng)處理的桉木原料的纖維呈束狀且個體結(jié)構(gòu)緊密,纖維完整無損,沒有明顯的碎化;堿性亞硫酸鹽預處理后,纖維發(fā)生一定程度的碎化,長度變小,切斷現(xiàn)象明顯,纖維碎片增多,纖維之間的結(jié)合變得松弛,且有很大程度的斷裂.堿性亞硫酸鹽預處理使桉木碳水化合物的結(jié)構(gòu)變得松散,碎化纖維的同時也改善了后續(xù)纖維素酶的可及度,從而最終提高酶解糖轉(zhuǎn)化率.酶解殘渣中的纖維素則已完全碎化,見不到明顯的纖維結(jié)構(gòu).2.2.4x射線衍射分析桉木原料、預處理樣及酶解殘渣的X射線衍射分析結(jié)果如圖3所示.由圖3可見,桉木經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,在16°、22°的兩個衍射峰都下降,尤其是代表結(jié)晶區(qū)強度的002面衍射峰(22°處的峰)下降得更為顯著.這說明預處理過程中纖維素部分結(jié)晶區(qū)變成了無定形區(qū).經(jīng)Segal公式計算得出:桉木原料的相對結(jié)晶度為61.22%,預處理后相對結(jié)晶度為52.44%.由此可見,桉木原料經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后纖維素的相對結(jié)晶度降低了14.34%.酶解殘渣的X射線分析結(jié)果表明其在16°和22°的兩個衍射峰衍射強度都明顯減小,尤其是16°的衍射峰基本消失,這說明酶解殘渣中所殘留的纖維素相對較小.2.3預處理樣品的酶分解實驗結(jié)果和分析2.3.1木糖、葡萄糖含量將經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理的桉木和未經(jīng)預處理的桉木木粉分別進行纖維素酶酶解實驗,結(jié)果見表3.從表3可以看出:桉木原料經(jīng)預處理后,酶解過程中木糖、葡萄糖得率明顯提高,所得木糖和葡萄糖量分別占桉木原料中木糖和葡萄糖量的67.33%和88.11%,與未經(jīng)預處理直接酶解所得的木糖、葡萄糖得率相比,分別提高了7.51倍和4.33倍.與其它的預處理相比,堿性亞硫酸鹽預處理不但有高的糖轉(zhuǎn)化率,而且酶解液中不會產(chǎn)生糠醛、羥甲基糠醛等后續(xù)發(fā)酵抑制劑.由此可見,堿性亞硫酸鹽預處理可有效提高桉木纖維素和半纖維素的酶解效率,其中對半纖維素的酶解效率的提高更為顯著.2.3.2原料的酶解效果將預處理樣酶解所得的殘渣經(jīng)冷凍干燥后,再用72%硫酸法測其殘留的糖組分及木質(zhì)素含量,結(jié)果見表4.從表4可以看出,酶解殘渣的主要成分是木質(zhì)素,同時結(jié)合表1所示結(jié)果計算可知,桉木原料中52.39%的木質(zhì)素可在酶解殘渣中得到回用;木糖和葡糖糖的殘留則相對較少,分別占原料中木糖和葡萄糖量的1.92%和4.71%.除此之外,酶解殘渣中還殘留相當量的酸溶木質(zhì)素、抽出物、灰分和醛酸等其它物質(zhì).3再酶解桉木原料的選擇(1)桉木原料經(jīng)堿性亞硫酸鹽預處理后,有部分木質(zhì)素和少量半纖維素被水解;纖維素的結(jié)晶度下降14.34%;預處理使得桉木碳水化合物