藍莓種苗組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程（征求意見稿）

1T/GDSMMXXXX—2023藍莓種苗組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了藍莓組織培養(yǎng)快速繁殖過程中的術(shù)語和定義、培養(yǎng)基制備、組培室消毒滅菌、組培苗生產(chǎn)等方面的技術(shù)。本文件適用于藍莓組織培養(yǎng)繁殖苗木。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB15/T1939—2020文冠果組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程NY/T391綠色食品產(chǎn)地環(huán)境質(zhì)量3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1外植體explant植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。外植體通常選擇生長健壯的無病蟲的植株上的正常器官或組織。3.2接種inoculation在無菌條件下將表面滅菌后的外植體或繼代、生根組培材料接入培養(yǎng)基的過程。4培養(yǎng)基配制4.1培養(yǎng)基配方4.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇WPAP培養(yǎng)基作為藍莓組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，具體成分見附錄A中的表A.1。4.1.2不定芽誘導培養(yǎng)基制備用于不定芽誘導的培養(yǎng)基，配方為：在所述WPA培養(yǎng)基上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）；在不定芽誘導培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度為1.0mg/L，萘乙酸（NAA）的濃度2T/GDSMMXXXX—2023為0.2mg/L。4.1.3繼代增殖培養(yǎng)基制備用于繼代增殖的培養(yǎng)基，配方為：在所述WPA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加6-芐氨基嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA在繼代增殖培養(yǎng)基中6-芐氨基嘌呤（6-BA）的濃度為1.0mg/L～3.0mg/L，萘乙酸（NAA）的濃度為0.2mg/L。4.1.4無菌生根培養(yǎng)基制備用于無菌生根的培養(yǎng)基，配方為：在所述WPA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加吲哚丁酸（IBA）4.2培養(yǎng)基母液及培養(yǎng)基配制按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。4.3環(huán)境與器具消毒滅菌按照DB15/T1939—2020執(zhí)行。5組織培養(yǎng)5.1外植體及其消毒5.1.1選取生長健康的藍莓幼嫩的球莖作為外植體，用中性洗滌劑洗滌球莖，以去除表面的污垢。5.1.2去除多余的葉片，干凈紙巾吸干表面水分，在超凈工作臺上，先用70%酒精浸泡30s，再用無菌水沖洗3次，每次3min。5.1.3轉(zhuǎn)入0.1%的升汞溶液中消毒8min～12min，最后用無菌水洗滌3次～5次，每次5min，得到消毒外植體。5.2不定芽誘導5.2.1在超凈工作臺內(nèi)，將消毒外植體切割成0.4cm×0.5cm的單芽。5.2.2將莖段接種于用于不定芽誘導的培養(yǎng)基；每瓶接1個外植體，分布均勻，封好瓶口后，注明品種代號、接種人員及日期等，放至培養(yǎng)室培養(yǎng)，誘導培養(yǎng)18d～22d，得到藍莓不定芽。5.2.3誘導培養(yǎng)條件如下：溫度為26℃±3℃,濕度為80%～90%，光照時間為14h/d，光照強度為8001ux～12001ux。5.3繼代增殖5.3.1將不定芽誘切除葉片和頂芽，接入繼代培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)20d～25d，得到藍莓叢芽。5.3.2接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm～2.0cm。5.3.3繼代增殖培養(yǎng)條件如下：溫度為26℃±3℃,濕度為50%～65%，光照時間為14h/d，光照強度為8001ux～12001ux。5.4無菌生根3T/GDSMMXXXX—20235.4.1當繼代增殖培養(yǎng)的藍莓無菌苗生長到3.0cm～5.0cm時，進行切繁，并保持每株均有一個不定芽，接入用于無菌生根的培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)15d～20d，得到藍莓幼苗。5.4.2接種數(shù)量根據(jù)培養(yǎng)容器的大小決定，要求材料擺布均勻，間距1.0cm～2.0cm。無菌苗在培養(yǎng)基中的插入深度為5mm～8mm，保持壯苗直立。5.4.3生根培養(yǎng)條件如下：溫度為28℃±3℃,濕度為70%～85%，光照時間為14h/d，光照強度為8001ux～12001ux。5.5煉苗藍莓幼苗生長至根長0.3cm、苗高5cm后，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開，室內(nèi)煉苗培養(yǎng)5d～7d。4T/GDSMMXXXX—2023（資料性附錄）WPA培養(yǎng)基給出WPA培養(yǎng)基的成分和配制方法。表A.1MS培養(yǎng)基混合母液配制表母液名稱編號化試名稱mg/L擴大倍數(shù)擴大后稱mg母液定容體積mL配置培養(yǎng)基吸取量mL/L大量元素ANH4NO34066000KNO340760003704014800BCaCl22O44044000CKH2PO417000鐵鹽DFeSO42O27.82780Na2EDTA·2H2O37.23720微量元素E22.32230ZnSO42O8.6860H