反相高效液相色譜法測(cè)定墊狀卷柏藥材穗花杉雙黃酮

反相高效液相色譜法測(cè)定墊狀卷柏藥材穗花杉雙黃酮

柏樹是科維托科的一種約700種植物。它分布在世界各地。中國(guó)約有50多種藥物，25種藥物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)?！吨袊?guó)藥典》2005年版收載為卷柏科卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring和墊狀卷柏Selaginellapulvinate(Hook.EtGrev.)Maxim的干燥全草。其味辛,平,歸肝、心經(jīng)。用于經(jīng)閉痛經(jīng),癥瘕痞塊,跌打損傷。卷柏碳化淤止血,用于吐血、崩漏、便血、脫肛。穗花杉雙黃酮(amentoflavone)是卷柏屬植物中的一種特征化學(xué)成分,有文獻(xiàn)報(bào)道穗花杉雙黃酮及其衍生物可作為一類新的天然的人組織蛋白酶抑制劑。SamSikKang等報(bào)道amentoflavone對(duì)由過氧化和β淀粉狀蛋白質(zhì)引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性有很強(qiáng)的保護(hù)作用,可對(duì)神經(jīng)退化性疾病如局部缺血性抽搐和阿爾滋海默癥有很好的治療作用。穗花杉雙黃酮有很好的抗炎作用,E.R.Woo等通過研究發(fā)現(xiàn)amentoflavone的抗炎機(jī)制在于其抑制了細(xì)胞核因子NF-κB在巨噬細(xì)胞的活化,從而抑制了氧化氮合酶的誘導(dǎo)生成。高效液相色譜(HPLC)法已經(jīng)廣泛用于天然活性成分的分離和分析,中國(guó)藥典(2005年版)還未見用HPLC法測(cè)定卷柏中穗花杉雙黃酮的含量,文獻(xiàn)中的報(bào)道也甚少,為更好地控制墊狀卷柏藥材及成藥的質(zhì)量,本研究對(duì)墊狀卷柏中的主要成分穗花杉雙黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定研究,為建立墊狀卷柏藥材及其制劑的標(biāo)準(zhǔn)提供參考。1機(jī)器、試劑和樣品1.1氣相色譜-質(zhì)譜ass-vp分析島津LC-2010A高效液相色譜儀,CLASS-VP色譜工作站,UV-2010A檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,四元低壓梯度泵。甲醇為色譜純,水為高純水,其余所用試劑均為分析純。1.2測(cè)試劑穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室自制,純度為98%。墊狀卷柏藥材采于西藏,由本研究所生藥室袁王俊博士鑒定。2重量測(cè)定2.1流動(dòng)相0.1%磷酸PurospherstarRP-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(65∶35),流速0.8mL/min,柱溫25℃,檢測(cè)波長(zhǎng)337nm。理論塔板數(shù)按穗花杉雙黃酮峰計(jì)算大于6000。2.2配制儲(chǔ)備液精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品1.9mg,加甲醇定容至10mL,配制成0.19mg/mL的儲(chǔ)備液。取1mL儲(chǔ)備液稀釋至5mL,配制成0.038mg/mL的工作液,作為對(duì)照品溶液。2.3特征參數(shù)分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、5、7、9μL注入高效液相色譜儀,保留時(shí)間值為20.45min。以穗花杉雙黃酮進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x),以穗花杉雙黃酮峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為y=4E+06x+86960,r=0.9999,表明穗花杉雙黃酮在0.038~0.342μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。2.4成分配液樣品溶液將干燥的墊狀卷柏粉碎,過60目篩,精密稱取0.030g置于10mL容量瓶中,加甲醇適量,冷浸過夜。超聲40min,放冷,用甲醇定容至10mL,搖勻,用微孔濾膜(0.45μm)濾過,即得樣品溶液。2.5精密度測(cè)試精密吸取同一對(duì)照品溶液10μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,分別測(cè)定峰面積,峰面積RSD為0.31%,表明儀器精密度良好。2.6樣品溶液的制備精密稱取同一樣品6份(每份0.030g),按樣品溶液制備方法制備6份樣品溶液。各進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.57mg/g,RSD為0.021%。表明本方法重現(xiàn)性好。2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液,每隔2h進(jìn)樣1次,測(cè)定并記錄峰面積,計(jì)算。RSD為0.057%,表明樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性較好。2.8對(duì)照品溶液制備采用加樣回收測(cè)定法。精密稱取已知穗花杉雙黃酮含量的同一份樣品6份,每份加入0.038mg/mL對(duì)照品溶液1.0mL,按樣品處理方法制備樣品溶液,每次進(jìn)樣10μL,測(cè)定并計(jì)算。穗花杉雙黃酮的平均回收率為101.2%,RSD為2.3%。2.9穗花杉雙黃酮含量測(cè)定按樣品溶液制備方法制備各樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣10μL,記錄并計(jì)算峰面積,得穗花杉雙黃酮的含量為0.36%。測(cè)定色譜圖見圖1。3討論3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取0.020g標(biāo)準(zhǔn)品置50mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,得0.4mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用紫外檢測(cè)器連續(xù)在200~400nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光度,根據(jù)結(jié)果我們確定了穗花杉雙黃酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為337nm。3.2樣品的超聲提取作者曾將樣品分成兩份,一份用甲醇冷浸24h后超聲,一份不冷浸直接用甲醇超聲提取,結(jié)果顯示冷浸24h后超聲提取的樣品穗花杉雙黃酮含量較高,為3.57mg/g,而直接用甲醇超聲提取的樣品穗花杉雙黃酮含量為2.85mg/g。另外,將甲醇冷浸24h后的樣品分別超聲25、40、60、90min,結(jié)果顯示樣品超聲40min即已提取完全。故本實(shí)驗(yàn)用甲醇冷浸24h后超聲40min的方法來提取。3.3色譜峰型的確定作者曾用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-2%乙酸水溶液等系統(tǒng)做流動(dòng)相,發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)的色譜峰型較好。但穗花杉雙黃