hbvdnac啟動子三鏈結(jié)構(gòu)的高并聯(lián)寡核苷酸鏈的合成與鑒定

hbvdnac啟動子三鏈結(jié)構(gòu)的高并聯(lián)寡核苷酸鏈的合成與鑒定

一些準分酸不僅可以通過與互補鏈核的結(jié)合形成雙鏈結(jié)構(gòu)，還可以通過與雙鏈核中含有豐富酪氨酸酸（同構(gòu)酪氨酸酸）的區(qū)域，特征法將其結(jié)合成三鏈結(jié)構(gòu)。這種能形成三鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Triplehelix-formingoligonucleotide,TFO)通過Hoogsteen或逆Hoogsteen氫鍵與雙鏈靶DNA同聚嘌呤區(qū)相互作用,纏繞于DNA的深溝內(nèi),并可阻止靶DNA與核酸聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白結(jié)合,抑制靶基因復制和表達。TFO使人工調(diào)控特定基因表達成為可能,為難治性DNA病毒感染的治療展示了一個新的方向。鑒于目前尚無根治乙型肝炎病毒感染的理想藥物,本實驗設計多種理論上有可能與HBV-DNAC啟動子區(qū)序列形成三鏈結(jié)構(gòu)的TFO,觀察其與HBV-DNAC啟動子區(qū)序列結(jié)合的親和性、特異性、篩選最佳TFO,為進一步的HBV基因轉(zhuǎn)錄抑制實驗奠定基礎,探索治療HBV感染的新方法。1材料和方法1.1準分酸的合成在GibcoBRL公司以亞磷酰胺三脂固相法合成圖1所示的脫氧寡核苷酸,經(jīng)C-18反相柱、聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。1.2寡核苷酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分別取兩對上述合成的互補寡核苷酸(Target1和Target2)的正鏈和副鏈各500pmol,混合,加5mol/LNaCl4μl、無菌超純水84μl,75°C水浴12min,逐漸冷至25°C,使互補的寡核苷酸雜交成雙鏈靶DNA,用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測證實雜交完全。然后以3′末端填充法標記靶DNA:取靶DNA40pmol,加20μCi[α-32P]dCTP(～3000Ci/mmol),10mmol/LdATP、dGTP、dTTP各1μl,大腸桿菌DNA聚合酶Iklenow片段10U,補充無菌超純水使反應總體積達20μl,30°C溫育30min,加0.5mol/LEDTA1μl終止反應,然后以SephadexG-50柱層析純化標記的靶DNA片段,并以熒光分光光度法測標記靶DNA濃度,用FH液體閃爍計數(shù)器測其放射活性,估算靶DNA放射比活性。1.3ris-hcl32P標記靶DNA片段1pmol(1300cpm)與不同終濃度的各種TFO混合于三鏈DNA結(jié)合緩沖液(20mmol/LTris-HClpH7.4,10mmol/LMgCl2,10%蔗糖)中,反應總體積10μl,37°C水浴過夜。結(jié)合反應產(chǎn)物點樣于15%聚丙酰胺凝膠(丙烯酰胺∶亞甲雙丙烯酰胺=19∶1)上,用TEM10電泳緩沖液(89mmol/LTris-硼酸pH8,10mmol/LMgCl2),在4°C環(huán)境中電泳(9V/cm)過夜。然后進行凝膠放射自顯影,并用薄層掃描儀測X線顯影帶的光密度。1.4反應平衡過程中tfo濃度的計算參照文獻,按下列公式計算三鏈DNA解離常數(shù)(Kd):Kd=[duplex][TFO][triplex]Κd=[duplex][ΤFΟ][triplex]式中triplex為三鏈DNA,duplex為雙鏈DNA,表示終濃度,當寡核苷酸與靶序列結(jié)合,反應體系中[triplex]=[duplex]時(即薄層掃描顯示X線片中三鏈DNA與雙鏈DNA條帶的光密度值相等),Kd=[TFO],由于反應體系中[TFO]>>[triplex],反應平衡后的TFO的終濃度的近似于其反應初濃度,故Kd值約等于反應體系中所加入的TFO濃度。參照Olivas的方法,以本實驗體系最好的TFO為參考基準,計算各TFO與靶序列結(jié)合的相對親和力(Relativeaffinity):Relativeaffinity=Kd.bestTFOKd.expTFOaffinity=Κd.bestΤFΟΚd.expΤFΟ式中Kd.bestTFO為本實驗體系中篩選出的最好的TFO與靶序列雜交形成的三鏈DNA的解離常數(shù),Kd.expTFO為本實驗所測各TFO與靶序列雜交形成的三鏈DNA的解離常數(shù)。1.5降解a/c三鏈DNA結(jié)合反應方法同凝膠滯留試驗,取結(jié)合反應產(chǎn)物8μl,加DNase1(終濃度15U/ml)、消化1min,加98%去離子甲酰胺-10mol/LEDTA-0.25%二甲苯青FF液5μl終止反應,90°C水浴變性5min,點樣于12%變性聚丙酰胺凝膠上,以1800V恒電壓,電泳2h,抽干凝膠,進行放射自顯影。同時按快速Maxam-Gilbort測序法測靶DNA的A+G序列。2結(jié)果2.1同聚氧化酶tfo及堿基配對堿基穩(wěn)定性的影響本研究寡核苷酸設計滿足以下兩個條件:①位于基因調(diào)控區(qū)(HBVC啟動子);②TFO的靶序列類似于同聚嘌呤序列(1734～1754)。設計TFO時我們注意到了堿基配對方式對堿基三聯(lián)體穩(wěn)定性的影響,為避免非典型三聯(lián)體形成,我們針對純同聚嘌呤區(qū)(1744～1754),以堿基配對標準方式,合成了4條11nt寡核苷酸;為了考察增加TFO長度對三鏈DNA形成的影響,還合成了1條21nt寡核苷酸,為排除TFO與雙鏈DNA非特異性結(jié)合的可能性,同時合成無關靶序列2和TFOc作為對照,見圖1。2.2與靶序列的結(jié)合在37°C、pH7.4環(huán)境中,分別將5種TFO以漸增濃度(0,5×10-11,2.5×10-10,5×10-10,2.5×10-9,5×10-9,2.5×10-8,5×10-8,2.5×10-7,5×10-7,2.5×10-6,5×10-6mol/L)與1pmol32P標記靶序列(target1)雜交,用聚丙酰胺凝膠電泳分離,然后進行放射自顯影。結(jié)果:①CT-TFO、GT-TFOp在本實驗所設計的濃度范圍內(nèi)均不能與靶序列結(jié)合{只見雙鏈靶DNA帶(duplex),無三鏈DNA帶出現(xiàn)};②GT-TFOap達5×10-8、AG-TFOs在2.5×10-9、AG-TFO1達2.5×10-9mol/L以上時,即能與32P-靶DNA結(jié)合{在雙鏈靶DNA帶后方,出現(xiàn)三鏈DNA帶(triplex)};③當GT-TFOap和AG-TFOs濃度達最高值時,三鏈DNA帶前方仍然存在雙鏈DNA帶;④當AG-TFO1濃度達2.5×10-8mol/L時,雙鏈DNA帶消失,只有三鏈DNA帶存在,見圖2。用薄層掃描儀分析X線片顯影帶的光密度,按前述方法計算出各TFO與靶序列形成三鏈DNA的解離常數(shù)及相對親和力,見表1。結(jié)果顯示,在37°C、pH7.4條件下,CT-TFO、GT-TFOp與32P-靶DNA結(jié)合的親和力十分微弱,其Kd均>>10-6mol/L,即使寡核苷酸濃度高達10-6mol/L,仍不能與靶序列結(jié)合成三鏈DNA。在相同條件下,GT-TFOap、AG-TFOs與靶序列結(jié)合的親和力較高;Kd分別為5×10-7mol/L,2.5×10-8mol/L。四條短寡核苷酸中AG-TFOs的Kd值最低,提示其與靶序列結(jié)合的親和力相對較高。與短AG寡核苷酸相比,21ntAG寡核苷酸與靶序列結(jié)合的親和力更高,Kd為3×10-9mol/L。2.3ag-tfol與靶序列雜交成三鏈dna的酶足跡試驗凝膠留滯試驗結(jié)果顯示(見圖2),對照寡核苷酸不能與靶序列(targetl)雜交成三鏈DNA(lane3);5×10-6mol/LAG-TFOl也不能與對照靶序列(target2)雜交成三鏈DNA(lane2)。對AG-TFO1與靶序列形成的三鏈DNA作酶足跡試驗,經(jīng)DNA酶切后電泳,放射顯影結(jié)果顯示見圖3。在靶序列純同聚嘌呤區(qū),隨著AG-TFOl濃度增高,逐漸形成一清晰的足跡(無DNA條帶),但在三鏈DNA中部的兩個非典型堿基三聯(lián)體處仍可見DNA條帶;對照寡核苷酸則無足跡效應(有DNA條帶)。3tfo與靶序列的結(jié)合HBVC啟動子負責調(diào)控前基因組RNA和前CmRNA的轉(zhuǎn)錄,而前基因組RNA不僅是翻譯HBV核殼蛋白,HBV-DNA多聚酶的信息RNA,也是逆轉(zhuǎn)錄復制HBV的模板,阻斷該區(qū)可阻止HBV-DNA的轉(zhuǎn)錄和復制,故我們選擇此區(qū)類似同聚嘌呤序列(1734～1745)為靶位點。本實驗合成的寡核苷酸分為二類,嘧啶型寡核苷酸(CT-TFO)和嘌呤型寡核苷酸(AG-TFO和GT-TFO)。理論上,嘧啶型寡核苷酸能與靶序列嘌呤鏈中的嘌呤間形成Hoogsteen氫鍵而形成三鏈DNA;但本實驗結(jié)果表明,在生理溫度和pH范圍內(nèi),CT-TFO不能與靶序列結(jié)合,可能與本實驗的pH值高于該類寡核苷酸所要求的酸性環(huán)境有關,說明未經(jīng)改造或修飾的CT-TFO不適用于生理條件下的HBV轉(zhuǎn)錄抑制實驗。本實驗兩條GT-TFO(GT-TFOp,GT-TFOap)所含堿基數(shù)目和堿基排列順序完全相同,但方向相反,GT-TFOp與靶鏈的方向平行,GT-TFOap與靶鏈的方向逆平行;理論上,含GT的TFO能通過Hoogsteen或逆Hoogsteen氫鍵平行或逆平行地與靶序列嘌呤鏈結(jié)合;但本實驗結(jié)果顯示,GT-TFOap能與靶序列結(jié)合,而GT-TFOp則否,可能與這兩條GT-TFO含成串的G有關,因含成串G的TFO易與靶序列同聚嘌呤鏈逆平行方向結(jié)合。本研究表明,AG-TFOs亦可與靶序列結(jié)合。比較AG-TFOs和GT-TFOap這兩條11nt寡核苷酸與靶序列的親和力,AG-TFOs高于GT-TFOap,說明在四種短TFO中,以AG-TFOs最好。在從4條11nt寡核苷酸中篩選出最好的AG-TFOs的基礎上,我們進一步延長AG-TFOs長度至21nt,以探討TFO長度對TFO與靶序列結(jié)合的親和力和特異性的影響,結(jié)果表明21ntAG-TFO與靶序列結(jié)合的親和力相當于11ngAG-TFOs的8.3倍,提示在一定范圍內(nèi),增加TFO鏈長度,有助于提高TFO與靶序列結(jié)合的親和力。對AG-TFOl與靶序列形成的三鏈DNA作酶足跡試驗結(jié)果顯示,在純同聚嘌呤區(qū)有清晰的足跡(無DNA條帶),說明此段三鏈DNA中的典型堿基三聯(lián)體結(jié)合牢固,從而保護靶鏈,不為DNA酶所切開;但在靶序列中部的兩個胸腺嘧啶處,卻無足跡形成(有DNA條帶),說明此處的非典型堿基三聯(lián)體(C*TA)結(jié)合松散,對DNA酶抵抗力弱,不能保護靶鏈,盡管我們選擇了在非典型堿基三聯(lián)體中最穩(wěn)定的胞嘧啶與胸腺嘧啶的配對方式。提示在設計TFO時,應權(quán)衡增加TFO長度的利弊,所選靶序列中嘧啶堿基的量越多,三鏈DNA的穩(wěn)定性將越差。本研究凝膠留滯試驗結(jié)果顯示,對照寡核苷酸不能與靶序列雜交成三鏈DNA,高濃度AG-TFOl也不能與對照靶序列雜交成三鏈DNA;酶足跡試驗結(jié)果顯示對照寡核苷酸無足跡效應。說明AG-TFOl與靶序列DNA結(jié)合成三鏈DAN具有高度的特異性。本實驗中,我們還觀察到11ntAG-TFOs和11ntGT-TFOα的濃度達最高值時,反應體系中仍有雙鏈DNA存在,可能是因為這兩種寡核苷酸中的G易形成自身相關結(jié)構(gòu),如G四聚體、二聚體等,降低了TFO與靶序