靈芝多糖的生物保健功能及發(fā)酵條件優(yōu)化研究進展

靈芝多糖的生物保健功能及發(fā)酵條件優(yōu)化研究進展

靈山是多孔菌科的一種推子菌。在古代，人們認為它對正氣和補充營養(yǎng)具有良好的效果，并且對藥物具有高度贊揚。現(xiàn)代科學檢測表明,靈芝在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、通過增強宿主免疫調(diào)節(jié)功能達到抗腫瘤作用、抗病毒作用、通過提高氧化酶活性而清除體內(nèi)自由基達到抗衰老的作用、降血脂等方面有著極其重要的醫(yī)學作用。隨著近年來對靈芝研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)靈芝多糖是靈芝的主要活性物質(zhì)之一,其重要性不言而喻。本文綜述了近年來國內(nèi)外對靈芝多糖的主要研究進展。1結構分析：靈堿多孔1.1不同種類多糖糖化學成分中單糖組成和比例如同其他的生物活性大分子,靈芝多糖的生物活性依賴于化學結構,因此,要研究靈芝多糖生物活性的機理,不可避免的要研究其化學結構。對靈芝多糖的化學結構的研究,主要集中于其單糖的組成、多糖分子量范圍、單糖連接方式等方面。近年來,隨著研究的不斷深入,對靈芝多糖的化學結構已經(jīng)有了一定的了解。雖然靈芝多糖化學結構由于靈芝種類的不同而有所差異,但其化學結構的某些方面是固定不變的。如,其單糖組成普遍D-葡萄糖、D-果糖糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖,差異主要體現(xiàn)在組成的種類和比例的不同。羅立新等通過研究確定,在靈芝的菌絲體和子實體中得到的多糖,其單糖的組成不同,而且單糖的組成比例也不同。菌絲體多糖單糖是D-2葡萄糖、D-2半乳糖、D-2甘露糖、D-2木糖、L-2巖藻糖、L-2鼠李糖,而子實體多糖卻是由D-2葡萄糖、D-2半乳糖、D-2甘露糖、D-2木糖、L-2阿拉伯糖、L-2鼠李糖組成。而在Ye等的研究中,一種水溶性多糖的單糖組成僅由D-葡萄糖、D-半乳糖和L-果糖組成。單糖之間的連接方式,主鏈以β-(1→3)、β-(1→4)糖苷鍵連接,支鏈以β-(1→6)糖苷鍵連接。多糖分子量隨著多糖種類的不同,有很大差異,但一般都以104D為數(shù)量級。1.2試驗方法包括測定山羊糖化學結構1.2.1不同分子量的分離對于靈芝多糖的分子量測量,一般采用凝膠過濾層析的方式測定。在實驗前,先將已知分子量的物質(zhì)通過凝膠層析柱,根據(jù)分子量大小的不同,通過凝膠的時間有所不同,可以得到一個關于分子量大小線性方程。通過收集到的靈芝多糖通過層析柱的時間或洗脫體積不同,可以得到準確的分子量大小。在Ye等利用HPLC的方法,利用Dextrans標準品T-5、T-12、T-25、T-50、T-80、T-150和T-270做出線性方程,得出分離到的多糖分子量為1.2×104D。Li等利用HPSEC的方法,同樣用Dextrans標準品做出線性方程,最終測得分離到得靈芝多糖分子量。1.2.2衍生化和蒸發(fā)光散色儀目前應用于多糖的單糖組成研究分析方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法及衍生化氣相色譜法等方法,其中衍生化氣相色譜法是目前多糖分析中最常用的手段。無論哪種方法,都要先將多糖水解,水解的方法主要有稀硫酸水解和三氟乙酸水解。在上述研究方法中,薄層色譜法操作簡單,但是對于含量較少的單糖作用不明顯,可用于初步檢測;HPLC法的使用受到單糖在紫外光吸收較弱的缺點的影響,需要先經(jīng)過衍生化或使用蒸發(fā)光散色檢測器,因此其應用范圍有限;多糖的組成分析多采用氣相色譜法,由于單糖的揮發(fā)性很低,所以在應用氣相色譜法對多糖的單糖組成進行分析時,必須首先要進行衍生化處理以增加其揮發(fā)性,常用的衍生化處理方法有硅烷化法和乙酰化法。Ye等的研究中,采用乙酰衍生化的方法,先將多糖用三氟乙酸水解后乙?；?利用高效離子交換層析,測得單糖的種類和數(shù)量。王賽貞等在研究中,將多糖經(jīng)三氟乙酸水解后,用1-苯基-3-甲基-5-吡啶啉酮(PMP)衍生化,在高效液相245nm紫外檢測,首次發(fā)現(xiàn)了多糖活性成分中含有核糖。Guan等在研究中,水解多糖使用的是特異性酶,如阿拉伯糖酶、木糖酶等,然后將水解得到的單糖由PMP衍生化,在分別經(jīng)過HPLC和HPSEC,最終完成單糖的識別。1.2.3紫外糖苷鍵法靈芝多糖中,單糖之間以糖苷鍵形式連接,其對多糖分子的生物活性有著重要意義。目前常用的糖苷鍵分析方法主要有高碘酸氧化和Smith降解、甲基化、部分酸水解、紅外光譜,核磁共振等分析方法。高碘酸氧化是通過一系列的氧化還原作用,使最終的水解產(chǎn)物通過紫外檢測,得出糖苷鍵的類型是l→4、1→6、1→2中的哪種。甲基化法先將多糖衍生化,在與氣相色譜、質(zhì)譜結合使用,可以準確知道組成多糖的各單糖種類、比例和各單糖的連接位置。部分酸水解是將多糖分解為一個一個容易檢測的小片段,并且可以在特殊糖苷鍵處斷裂,從而推斷出多糖的大概結構。在趙桂敏等的研究中,就綜合使用了這幾種方法來測定提取的多糖結構,最終確定了多糖SGL2Ⅱ22由葡萄糖和半乳糖組成,為少分支結構,由1→3連接和1→6連接的葡萄糖構成主鏈,部分1→6連接葡萄糖在3位或4位有分支,側(cè)鏈為1→4連接的半乳糖,分支末端殘基為葡萄糖。2多香味睡眠功能2.1不同給藥劑量對嚴格降壓藥的影響隨著人們生活水平的提高,人口老齡化以及肥胖發(fā)生率的增加,糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。糖尿病在中國的發(fā)病率達到2%,據(jù)統(tǒng)計,中國已確診的糖尿病患者達4000萬,并且呈逐年上升趨勢。糖尿病在臨床上主要以高血糖為標志,如何降低人們的血糖,預防人們患糖尿病成為關鍵。近年來隨著靈芝的保健作用得到重視,其中多糖作為主要的活性物質(zhì),其降低血糖的效果顯著。黃智璇等研究發(fā)現(xiàn),靈芝多糖對降低血糖有很好的效果。由四氧嘧啶致高血糖小鼠,在高劑量(400mg/kg)靈芝多糖條件下,小鼠血糖濃度為13.53mmol/L,而對照組小鼠血糖濃度為14.68mmol/L,血糖降低7.83%;由去甲腎上腺素致高血糖小鼠,高劑量(400mg/kg)靈芝多糖條件下,小鼠血糖濃度為6.9mmol/L,而對照組小鼠血糖濃度為8.71mmol/L,血糖降低20.8%。趙晶等除了研究了靈芝多糖對降血糖的作用外,還研究了不同劑量的靈芝多糖隨時間對降血糖的作用,發(fā)現(xiàn)在200mg/kg以下,血糖隨時間的變化很小,但高于200mg/kg后,降低血糖效果隨時間變化十分明顯。2.2對降血脂的作用高血脂癥,指血液中一種或幾種脂肪成分的增加,如膽固醇、脂蛋白、甘油三酯等,是造成動脈硬化癥和心臟病發(fā)生的一個重要危險因子。研究顯示,靈芝多糖對降血脂有很好的效果。吳鋒等在研究靈芝多糖對血脂的作用時,發(fā)現(xiàn)使用靈芝多糖的小鼠的血脂中的膽固醇(TG)和甘油三酯(TC)都有明顯降低,而對于脂蛋白,其中高密度脂蛋白(HDL)沒有明顯的效果,而低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白(LPa)有非常明顯的降低。陳偉強等發(fā)現(xiàn),在大鼠血清中TG和TC的含量,隨靈芝多糖劑量的增加而降低,在靈芝多糖劑量在400mg/kg條件下,TC降低47%、TG降低46.87%。2.3不同的對mmp-9mrna表達的抑制作用實驗表明,靈芝多糖可以在一定程度上抑制腫瘤的活性,但靈芝多糖對腫瘤細胞的抗癌構效關系和抗癌機制仍不明了。曹琦珍等的研究表明,靈芝多糖對人肺癌PG細胞增殖無直接抑制作用,但是對PG細胞的運動性和黏附性有明顯的抑制,對金屬蛋白酶MMP-9,不但抑制其活性,并且對MMP-9mRNA的表達也有不同程度的抑制。同樣,在李穎博等的研究中,證實了靈芝多糖對人前列腺癌細胞(PC-3M)并沒有毒害作用,對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖也沒有作用,但是對這兩種細胞的運動性和黏附性有明顯的抑制。因此,有種對靈芝多糖的抗腫瘤機理的說法是,通過抑制腫瘤細胞的運動和黏附特性達到的。林華型在總結了多人的結論后,認為靈芝多糖并不能直接抑制或殺死腫瘤細胞,也不能誘導腫瘤細胞凋亡,其抑制腫瘤細胞的作用是通過通過介導加強宿主免疫功能而激活機體內(nèi)各種免疫應答而實現(xiàn)的。而李建軍等的研究支持了林華型的結論,靈芝多糖會使在體腫瘤細胞DNA和RNA的比值下降,由此達到抑制腫瘤細胞的效果,但是離體腫瘤細胞卻沒有這種效果,因此說明靈芝多糖主要通過免疫介導對腫瘤細胞產(chǎn)生毒性作用。2.4對免疫病理的調(diào)節(jié)作用人體免疫系統(tǒng),可以抵御外來細菌、病毒和其他有害物質(zhì)的侵襲,還能清除體內(nèi)衰老、突變、惡化或死亡的細胞。靈芝多糖主要是通過對淋巴細胞、巨噬細胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)等免疫細胞的作用來調(diào)節(jié)機體的免疫功能,其增強免疫應答機制之一,就是通過對多種細胞因子進行誘生或促誘生作用。作為生物反應調(diào)節(jié)劑,它不僅能夠激活T、B淋巴細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK)等免疫細胞,還能活化補體,促進細胞因子的生成,全面發(fā)揮對機體的調(diào)節(jié)作用。研究表明,靈芝多糖還對淋巴細胞中的NK細胞有增強作用。TNF-α、L-2、L-10等在免疫系統(tǒng)中占有重要地位。TNF-α在機體免疫防護方面有重要作用,還參與集體的免疫病理損傷;L-2有促進淋巴細胞增殖、促進B淋巴細胞分泌抗體、增強T細胞殺傷及增強NK細胞活性等作用。周桂琴等的研究結果表明靈芝多糖可以抑制腫瘤生長,其機理可能是通過刺激淋巴細胞,影響了TNF-α、L-2、L-10等因子的分泌,從而增強細胞及體液免疫,巨噬細胞的吞噬作用。任瑋等的研究也顯示,靈芝多糖可提高小鼠的免疫功能,增強NK細胞數(shù)量的作用,通過對L-2、L-4和IFN-γ的影響,調(diào)節(jié)免疫應答。馮鵬等的研究結果表明,靈芝孢子多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的體液免疫功能和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能,并且對荷瘤小鼠的外周血的T細胞亞群中的殺傷性T細胞和輔助性T細胞均有一定的激活作用,而且對荷瘤小鼠的NK細胞具有一定的激活作用。李麗等在研究中發(fā)現(xiàn),靈芝多糖可以增加小鼠血清中干擾素IFN-γ的含量,對腫瘤生長也有抑制作用,在劑量的使用上,以中劑量(10mg/kg)的抑瘤率最好。2.5對細胞的抗氧化作用近年來,眾多學者對人衰老的原因提出了很多學說,如免疫學說、遺傳學說、自由基學說等,其中,自由基學說越來越引起人們的關注。Harman提出衰老的自由基學說,自由基是在細胞代謝過程中不斷產(chǎn)生的,具有強氧化性,在細胞內(nèi)可以與多種生物大分子,如蛋白質(zhì)、DNA、細胞膜中的不飽和脂肪酸等發(fā)生反應,從而導致多聚核蛋白解聚、抑制蛋白質(zhì)的合成,而這些正是細胞衰老的特征。最近的研究發(fā)現(xiàn),靈芝多糖對細胞的抗氧化作用十分明顯。游育紅等研究了靈芝多糖對ECV304氧化損傷的保護作用,結果顯示靈芝多糖可以減少氧自由基對細胞器的損傷,對細胞凋亡、細胞壞死也有很好的抑制作用,使細胞存活率提高,證明了靈芝多糖保護細胞、抗氧化的作用。王宏勛等研究了混合使用多糖對去除羥自由基的效果,發(fā)現(xiàn)復合使用多糖比僅使用一種多糖去除羥自由基效果要好,并且探索了不同比例的靈芝多糖和枸杞多糖對去除羥自由基的效果。胡太平等首次證明了,在血管壁中產(chǎn)生O2·的NHDPH氧化酶酶系的活性受到靈芝多糖的抑制,而O2·含量過高會導致多種高血壓病癥的發(fā)生。3不同碳源、不同微量元素和維生素a由于靈芝多糖突出的保健功效,因此靈芝商品很受歡迎。對靈芝的生產(chǎn),傳統(tǒng)的方法是以固體培養(yǎng)基培植,但這種方法有生產(chǎn)周期長、生產(chǎn)效率低等因素的制約,無法實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而液體發(fā)酵技術的出現(xiàn),使得大規(guī)模生產(chǎn)靈芝成為可能。液體發(fā)酵得到的靈芝,在營養(yǎng)成分方面,如靈芝多糖、靈芝酸等,比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的靈芝子實體還要高。因此,液態(tài)發(fā)酵成為獲得靈芝多糖的重要手段。眾多學者優(yōu)化靈芝發(fā)酵的條件,主要從發(fā)酵的營養(yǎng)條件、菌種接種量、pH值、DO、溫度等方面加以控制,從而達到提高靈芝多糖產(chǎn)量的目的。張志軍等研究了種子培養(yǎng)4、5、6d情況下對靈芝多糖發(fā)酵的影響,以培養(yǎng)5d的種子發(fā)酵的多糖產(chǎn)量在第4天達到最高,產(chǎn)量為4.3g/L。Changa等在研究中考察了多種因素對靈芝多糖和菌絲量的影響,麥芽提取物可以極大的提高多糖的含量,而使用赤砂糖比單純使用蔗糖效果要好;氮源選擇了酵母浸膏和脫脂乳,其中脫脂乳含有含氮化合物和乳糖,這會促進多糖的產(chǎn)生;并嘗試了加入植物油,其對提高產(chǎn)量有一定的效果。Hsieh等的研究結果表明,當以葡萄糖作為碳源時,靈芝胞外多糖濃度隨著葡萄糖濃度升高而升高,在葡萄糖質(zhì)量濃度為60g/L時,多糖質(zhì)量濃度達到1.79g/L;在以玉米漿為氮源時,多糖濃度隨玉米漿濃度升高而下降,與菌絲量恰好相反;在考察鎂鹽和磷源對多糖的影響時,發(fā)現(xiàn)鎂鹽的影響更加顯著,磷源對菌絲生長有益,對產(chǎn)生多糖有抑制作用。Lee等研究了靈芝胞內(nèi)多糖和胞外多糖的產(chǎn)生條件,認為麥芽糖和葡萄糖是有效碳源,在25℃、60g/L葡萄糖、8~12d培養(yǎng)的條件下,有助于胞外多糖的高產(chǎn);而在10~15℃、低碳氮比、最少10d的條件下,有助于胞內(nèi)多糖的高產(chǎn)。陳志玲等研究了幾種微量元素和維生素對靈芝多糖的影響,發(fā)現(xiàn)靈芝多糖含量以添加1.0‰VB1最高,其培養(yǎng)液中為6.00g/L,菌絲體中為552.5mg/g;添加0.1‰~0.2‰。硫酸鋅和1.0‰復合VB1,能顯著提高靈芝多糖含量,添加適量的鐵、鋅也能顯著提高靈芝多糖。Zhu等在研究中發(fā)現(xiàn),可以加入從夏塊菌(TuberaestivumVittad.)提取出的真菌刺激素來提高靈芝多糖的產(chǎn)量。4超聲波促進多糖提取發(fā)酵產(chǎn)生靈芝多糖,主要包括兩個部分,即胞內(nèi)多糖和胞外多糖。胞外多糖由于直接在發(fā)酵液中,所以易于提取。而胞內(nèi)多糖在細胞壁或細胞間質(zhì)中,所以需要先破