血管緊張素在廢用性肌萎縮過(guò)程中對(duì)骨骼肌肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的影響

血管緊張素在廢用性肌萎縮過(guò)程中對(duì)骨骼肌肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的影響

根據(jù)這項(xiàng)研究，骨肌肉纖維可以改變運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性，以及不同代謝功能的要求，骨肌肉纖維的大小和類(lèi)型可以產(chǎn)生相應(yīng)的適應(yīng)性改變。在運(yùn)動(dòng)員停訓(xùn)之后,內(nèi)分泌水平也隨之改變,血管緊張素Ⅱ分泌水平降低,然而血管緊張素Ⅱ降低后會(huì)對(duì)機(jī)體造成什么影響還是未知數(shù),本實(shí)驗(yàn)的目的就是施加外源性血管緊張素Ⅱ,通過(guò)肌纖維百分比的變化探討血管緊張素Ⅱ?qū)U用性肌萎縮大鼠骨骼肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的影響,為改善運(yùn)動(dòng)員停訓(xùn)、航空航天、某些代謝型疾病引起肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1懸吊+angta選用健康雌性SD大鼠32只,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,SPF級(jí),體重200～220g,按隨機(jī)配對(duì)原則隨機(jī)分為4組(n=8):即假手術(shù)組(C)、AngⅡ組(CA)、懸吊組(T)和懸吊+AngⅡ(TA)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)北京體育大學(xué)分會(huì)批準(zhǔn)。1.2血管緊張素15的假手術(shù)采用陳杰改良式大鼠尾部懸吊法建立廢用性肌肉萎縮模型。大鼠單籠飼養(yǎng),尾部懸吊,前肢著地,后肢懸空,身體長(zhǎng)軸與水平面呈30°角,在籠內(nèi)可自由活動(dòng),進(jìn)食飲水,室溫保持在20～25℃,人工控制室內(nèi)照明,每晝夜均保持12h光照和黑暗交替循環(huán)。對(duì)CA組和TA組包埋血管緊張素Ⅱ緩釋泵,C組和T組進(jìn)行假手術(shù)。假手術(shù)組和手術(shù)組大鼠先稱(chēng)體重,然后用2%戊巴比妥鈉按照0.3ml/100g體重的劑量麻醉。然后碘酒擦拭消毒,提起頸后部肌肉,于兩肩胛骨之間縱向切開(kāi)一小口,左右止血鉗張開(kāi)小口,背部置入緩釋泵,緩釋速率為200ng/(kg·min),14d劑量,然后用手術(shù)針線縫合傷口。假手術(shù)組緩釋泵內(nèi)裝入的是生理鹽水,手術(shù)組緩釋泵內(nèi)裝入的是血管緊張素Ⅱ。懸吊持續(xù)14d。1.3肌組織塊的制備戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物,迅速取出左、右側(cè)比目魚(yú)肌稱(chēng)重,切除兩端肌腱,在肌腹中段處取2×2×6(mm3)的組織塊,在冰塊上用OCT包埋組織塊,投入液氮預(yù)冷的異戊烷溶液中冷凍后放入液氮中,-80℃冰箱保存。1.4肌球蛋白atp酶組織化學(xué)染色用8μm厚連續(xù)橫斷冰凍切片(-20℃)。參照Ogilvie和Feeback(1990)以及王月麗、周越(2008)改良的“異染性染料-腺苷三磷酸酶法”鑒別肌纖維類(lèi)型。用pH值為4.35的預(yù)孵液進(jìn)行肌球蛋白ATP酶組織化學(xué)染色,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有緩沖液都經(jīng)pH測(cè)試儀準(zhǔn)確調(diào)定,使pH值相差均小于±0.01。其結(jié)果為:I型肌纖維深藍(lán)色,IIa型肌纖維為白色,IIb顏色為淡藍(lán)色,即介于I型和IIa型顏色之間。1.5肌纖維類(lèi)型分型骨骼肌類(lèi)型切片為10×10倍進(jìn)行拍照,圖像用ImageJ1.42軟件進(jìn)行肌纖維類(lèi)型分型計(jì)算;收集的數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)。2懸吊過(guò)程對(duì)比目魚(yú)肌復(fù)雜性的影響C組CA組從整體上看,肌細(xì)胞飽滿,輪廓清晰,而T組肌細(xì)胞明顯萎縮變形,間隙較大,TA組較T組相比肌細(xì)胞有所改善。四組比目魚(yú)肌濕重體重比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)顯示,懸吊之后T與TA組比目魚(yú)肌濕重體重分別與C、CA組相比有非常顯著性差異(P<0.01),說(shuō)明懸吊過(guò)程造成了比目魚(yú)肌的肌萎縮,血管緊張素Ⅱ在懸吊過(guò)程中沒(méi)有表現(xiàn)出抑制比目魚(yú)肌萎縮的作用。從各組Ⅱ型肌纖維百分比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果來(lái)看,T組與C組相比Ⅱ型肌纖維百分比顯著升高(P<0.05),說(shuō)明在肌萎縮過(guò)程中,出現(xiàn)了肌纖維類(lèi)型從Ⅰ型向Ⅱ型的轉(zhuǎn)化,TA組與T組相比Ⅱ型肌纖維百分比則顯著降低(P<0.05),說(shuō)明在肌萎縮過(guò)程中,血管緊張素Ⅱ可以抑制肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)化。雖然在正常情況下,血管緊張素Ⅱ?qū)Β蛐图±w維百分比沒(méi)有影響,但是CA組部分大鼠出現(xiàn)了Ⅱb型肌纖維,而懸吊后TA組部分大鼠也出現(xiàn)了Ⅱb型肌纖維,推測(cè)血管緊張素Ⅱ具有使Ⅱa型肌纖維向Ⅱb型肌纖維轉(zhuǎn)化的作用(圖1,表2)。3血管緊張素在肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,懸吊造成的肌萎縮使肌纖維類(lèi)型出現(xiàn)了Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化,Ⅱ型肌纖維百分比由對(duì)照組的17.69%上升到21.63%,懸吊組與對(duì)照組相比有顯著差異。ATPase染色結(jié)果也很明顯,T組Ⅱ型肌纖維數(shù)量明顯增多,肌纖維細(xì)胞間隙較大,且在切片過(guò)程中比較容易出現(xiàn)碎片現(xiàn)象。安靜狀態(tài)下施加血管緊張素Ⅱ?qū)Β蛐图±w維總百分比沒(méi)有影響。但是從ATPase染色結(jié)果顯示,安靜狀態(tài)下施加血管緊張素Ⅱ后使部分大鼠比目魚(yú)肌快肌出現(xiàn)了Ⅱa型向Ⅱb型的轉(zhuǎn)化,這是以往實(shí)驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)或注意到的,值得深入研究。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,在廢用性肌萎縮過(guò)程中施加血管緊張素Ⅱ因素后,顯著抑制了Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象,Ⅱ型肌纖維百分比與T組有顯著性差異。ATPase染色結(jié)果顯示TA組肌細(xì)胞較T組緊密,Ⅱ型肌纖維數(shù)量明顯減少,并且我們發(fā)現(xiàn)與CA組一樣的情況,即出現(xiàn)Ⅱb型肌纖維。Pette等研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期低頻刺激可使嚙齒動(dòng)物骨骼肌肌球蛋白重鏈(MHC)出現(xiàn)MCHⅡb※MHCⅡd/x※MHCⅡa※MHC1β的轉(zhuǎn)變過(guò)程;值得注意的是,在這個(gè)肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中還伴隨著肌肉張力的降低及ATP磷酸蛋白的相應(yīng)改變。有研究顯示,中間型肌纖維在肌纖維轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)顯著增加,其中在兔骨骼肌由快轉(zhuǎn)慢的過(guò)程中,中間型肌纖