第八章 植物細(xì)胞培養(yǎng)

第七章

植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)

2.細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)

一般細(xì)胞都很小,要用顯微鏡才能看到。1665年,英國人Hooke用他改進(jìn)的顯微鏡觀察軟木的結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)并命名了細(xì)胞。

3.細(xì)胞學(xué)說

德國植物學(xué)家Schleiden和動物學(xué)家Schwan于1838年提出細(xì)胞學(xué)說。

細(xì)胞學(xué)說內(nèi)容：

A、植物和動物的組織由細(xì)胞構(gòu)成;

B、所有的細(xì)胞由細(xì)胞分裂或融合而成;

C、卵和精子都是細(xì)胞;

D、一個細(xì)胞可分裂形成組織。

本世紀(jì)三十、四十年代,電子顯微鏡研制成功,放大倍數(shù)從光鏡的1200倍擴(kuò)大到幾十萬倍。電子掃描顯微鏡

細(xì)胞的顯微及超微結(jié)構(gòu)顯微結(jié)構(gòu)（microstructure）指在光學(xué)顯微鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)。超微結(jié)構(gòu)（ultrastructure）指在電子顯微鏡下觀察到的結(jié)構(gòu)，也稱亞顯微結(jié)構(gòu)。光鏡電鏡電鏡人們借助電子顯微鏡，在自然界中發(fā)現(xiàn)了比細(xì)胞更簡單的生命有機(jī)體——病毒。病毒是目前已知的最小的生命單位,它們只是由蛋白質(zhì)外殼包圍核酸芯子所組成。

植物細(xì)胞的形狀與大小植物體由細(xì)胞構(gòu)成（單細(xì)胞或多細(xì)胞）細(xì)胞的大小通常在20-50

m之間細(xì)胞的形態(tài)多樣，球形、多面體、立方體、長形等第一節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)與結(jié)構(gòu)不同植物其細(xì)胞的大小不同，最小的細(xì)胞是支原體，直徑僅有0.1微米左右；西瓜瓤細(xì)胞直徑約1毫米；苧麻莖纖維細(xì)胞長可達(dá)550毫米。植物細(xì)胞的形狀也多種多樣，有長管狀、球狀等，植物細(xì)胞的形狀取決于其生理功能。

（二）植物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)

植物細(xì)胞雖然大小不同，形狀多樣，但是一般有相同的基本結(jié)構(gòu)。

顯微結(jié)構(gòu)(microscopicstructure)：由細(xì)胞壁和原生質(zhì)體構(gòu)成，后者又由質(zhì)膜(plasmalemma)、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）和細(xì)胞核（nucleus）構(gòu)成。

亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopicstructure)：在電子顯微鏡下顯示的細(xì)胞結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。植物細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁

(cellwall)細(xì)胞原生質(zhì)體(protoplast)細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)和細(xì)胞核(nuclear)細(xì)胞器(organelle)質(zhì)膜(plasmamembrane)

細(xì)胞結(jié)構(gòu)全圖

電鏡下的細(xì)胞質(zhì)體類型顏色功能葉綠體綠色光合作用有色體黃-紅色積累脂類和淀粉白色體無色合成淀粉，脂肪，蛋白質(zhì)

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器種類很多。

(3)質(zhì)體

質(zhì)體是植物細(xì)胞特有的細(xì)胞器，幼期未分化成熟的，成為前質(zhì)體。

分化成熟的質(zhì)體可根據(jù)其顏色和功能不同，分為葉綠體（Chloroplast）、有色體（Chromoplast）和白色體（Leucoplast）三種主要類型。

在個體發(fā)育上，葉綠體來自前質(zhì)體，由前質(zhì)體發(fā)育成葉綠體。

B.有色體有色體含有類胡蘿卜素。類胡蘿卜素包括:葉黃素（黃色）、胡蘿卜素（紅色）。部分植物的花瓣、成熟的果實(shí)、胡蘿卜的貯藏根、衰老葉片都存在有色體。有色體的形狀有球形和不規(guī)則形狀。

C.白色體

白色體不含色素，存在于甘薯、馬鈴薯等植物的地下貯藏器官中。按照功能不同，可以分為：造粉體、造油體和造蛋白質(zhì)體。在植物發(fā)育過程中，質(zhì)體可以相互轉(zhuǎn)化。

光鏡下的淀粉粒（未染色）光鏡下的淀粉粒（染蘭色）油和脂肪植物細(xì)胞中，油和脂肪或多或少都存在，但通常是存在油料植物種子或果實(shí)中，由造油體合成。如花生、大豆、油菜的子葉，蓖麻的胚乳，都含有大量脂肪，可用蘇丹Ⅲ染色。

植物含油和脂肪模式圖，

人工蓖麻種子，含有脂肪的染色層第一節(jié)、植物細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

原理概述：

1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt提出：

細(xì)胞器官和組織可以不斷分割直至單個細(xì)胞，并嘗試分離植物并進(jìn)行培養(yǎng)沒成功－－“植物組織培養(yǎng)之父”

19世紀(jì)30年代Schwan和Schleiden創(chuàng)立了細(xì)胞學(xué)說:

植物和動物都是由細(xì)胞構(gòu)成的，細(xì)胞進(jìn)行分裂而增多，并組建生物體。若具備的條件能同在活體內(nèi)的一樣，每個細(xì)胞都用能獨(dú)立生存和發(fā)展。

1943年，美國的White提出植物細(xì)胞全能性的學(xué)說：每個植物細(xì)胞具有該植物的全部遺傳信息和發(fā)育成完整植株的能力。（單個細(xì)胞經(jīng)人工培養(yǎng)，通過細(xì)胞分裂能恢復(fù)完整植株，并具有原植株的全部遺傳性。）植物培養(yǎng)中的幾個發(fā)現(xiàn)：

1934年，荷蘭植物學(xué)家溫特發(fā)現(xiàn)生長素－吲哚乙酸。后來相繼發(fā)現(xiàn)吲哚丁酸、奈乙酸、2,4－二氯苯氧乙酸（2,4-D酸）等。同時期發(fā)現(xiàn)B族維生素對植物細(xì)胞的重要性。

1953年，繆爾由無菌的冠癭組織的懸浮培養(yǎng)物及易碎的愈傷組織分離得到單個細(xì)胞，通過看護(hù)培養(yǎng)使細(xì)胞分裂生長－－開創(chuàng)了單細(xì)胞無性繁殖的工作。

1956年，米勒等在鯡魚精子DNA熱壓水解產(chǎn)物中，發(fā)現(xiàn)了有高度活力的促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽形成的物質(zhì)，鑒定結(jié)構(gòu)式，命名為激動素。促芽效果較腺嘌呤高許多，替代腺嘌呤。建立了激動素/生長素比例控制器官分化的激動模式。

1958年，施圖爾德等從胡蘿卜根韌皮部愈傷組織獲得單細(xì)胞，并經(jīng)誘導(dǎo)形成胚狀體再生植株－－這是世界上首次通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了植物細(xì)胞具有全能性。

進(jìn)入20世紀(jì)60年代后期，植物組織培養(yǎng)開始走向大規(guī)模的應(yīng)用階段。

1960年莫雷爾采用蘭屬的莖尖培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了去病毒和快速繁殖兩個目的。

按照根尖－－原球莖－－小植株的方式而再生。（按該方法，一年內(nèi)1個半花莖很容易地繁殖出400萬株相同遺傳性的健康植物。）應(yīng)用類似的方法，至今66屬以上的蘭科植物納入試管繁殖的體系。

1974年，格雷沙夫從葡萄花藥培養(yǎng)中，得到單倍體愈傷組織。

1975年、羅薩蒂從草莓花藥培養(yǎng)中，獲得小孢子發(fā)育的植株。

我國,20世紀(jì)30年代羅宗洛和李繼侗就已經(jīng)成為遠(yuǎn)東植物培養(yǎng)的先驅(qū)者。

羅宗洛主要從事離體根尖的培養(yǎng)。

李繼侗發(fā)現(xiàn)了銀杏胚乳提取物對離體胚發(fā)育的促進(jìn)作用。

20世紀(jì)80年代，我國研究重點(diǎn)明顯傾向于無性系的快速繁殖，并已進(jìn)入不同的應(yīng)用階段，如：草莓、甘蔗、波蘿、香蕉、各色觀賞植物等。目前，番茄、辣椒、馬鈴薯、生菜和花卉等也在應(yīng)用。一、植物細(xì)胞全能性及分化（一）、植物細(xì)胞全能性：

是指植物細(xì)胞的每個活細(xì)胞都具有該植物全套遺傳信息，與合子一樣，具備發(fā)育成完整植株的潛能。

細(xì)胞全能性：

是細(xì)胞的某種特征，有這種能力的細(xì)胞保留形成有機(jī)體所有細(xì)胞類型的能力。

細(xì)胞全能性的實(shí)現(xiàn)：通過3個途經(jīng)－－A；B；C循環(huán)

A循環(huán)（生命周期）：以孢子體和配子體的世代交替實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能性。

B循環(huán)（細(xì)胞周期）：表示細(xì)胞的核質(zhì)周期。通過核質(zhì)的相互作用，DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，為細(xì)胞全能性形成和保持奠定基礎(chǔ)。

C循環(huán)（組織培養(yǎng)周期）：植物體器官、組織或細(xì)胞與供體失去聯(lián)系，無菌條件下，在人工合成的培養(yǎng)基中進(jìn)行異養(yǎng)代謝，通過細(xì)胞脫分化、分裂、再分化過程實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能性。減數(shù)分裂受精作用細(xì)胞全能性種子幼年時期無性繁殖典型一致的無性系或品種成年時期花的形成翻譯轉(zhuǎn)錄復(fù)制DNA基因克隆愈傷組織全能性的實(shí)現(xiàn)分化游離細(xì)胞或原生質(zhì)體原胚胚狀體人工種子試管小植株整體植株重建

生命周期（A循環(huán)）細(xì)胞周期（B循環(huán)）與供體失去聯(lián)系的分生組織（異養(yǎng)狀態(tài)）組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）細(xì)胞全能性的實(shí)現(xiàn)與利用胡蘿卜的愈傷組織菠蘿的愈傷組織

三者之間的關(guān)系：

生命周期（A循環(huán)）是通過細(xì)胞周期（B循環(huán)）來實(shí)現(xiàn)全能性的；

細(xì)胞周期中DNA的重組與克隆（B循環(huán)）也可通過組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化和表達(dá)－B循環(huán)和C循環(huán)結(jié)合可繁殖有特殊遺傳性狀或目的基因的個體；

組織培養(yǎng)周期（C循環(huán)）又必須通過生命周期（A循環(huán)）來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能性－－組織培養(yǎng)產(chǎn)生的個體再進(jìn)入A循環(huán)。（二）、植物細(xì)胞分化細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因差別表達(dá)的結(jié)果。1、低等植物細(xì)胞分化現(xiàn)象：*藻類植物單細(xì)胞植物體無分化；*綠藻門的空球藻屬開始營養(yǎng)與繁殖作用的細(xì)胞分化；*褐藻門的海帶外形有片、柄、假根的分化，內(nèi)部有表皮、皮層、髓細(xì)胞的分化。*細(xì)菌是單細(xì)胞生物，也有營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢分化現(xiàn)象。*

真菌－－產(chǎn)生各類生理上有性別差異孢子的現(xiàn)象，是一種細(xì)胞分化現(xiàn)象。葫蘆蘚球溯蘚并齒蘚粗葉泥炭蘚金藻角藻藍(lán)綠藻赤灣異彎藻地衣地衣松蘿－地衣巖石苔蘚樹上苔蘚石松藻蘚－藻苔水生真菌的菌絲問荊幽門螺旋桿菌人工種子2、高等植物細(xì)胞分化現(xiàn)象高等植物分化較低等植物更復(fù)雜、更多樣化。*合子第一次分裂－－胚細(xì)胞（頂細(xì)胞）和柄細(xì)胞（基細(xì)胞）的分化；*胚細(xì)胞分裂、分化形成具根端和莖端的胚－－形成植物體不同功能的各個器官和組織。注：分化是進(jìn)化的表現(xiàn)，分化水平越高細(xì)胞分工越細(xì)，機(jī)體代謝水平越高。（三）、離體條件下植物細(xì)胞的分化：

多種植物的不同部分細(xì)胞具有強(qiáng)烈的再生能力，離體培養(yǎng)時，條件適合，已分化的組織或細(xì)胞原有的分化狀態(tài)不再通過細(xì)胞分裂傳遞和保持下去，而發(fā)生脫分化現(xiàn)象。

愈傷組織：原意指植物因受創(chuàng)傷而在傷口附近產(chǎn)生的薄壁組織，現(xiàn)已泛指經(jīng)細(xì)胞與組織培養(yǎng)產(chǎn)生的可傳代的未分化細(xì)胞團(tuán)。是一團(tuán)無特定結(jié)構(gòu)和功能的松散的薄壁細(xì)胞。這些細(xì)胞大小、形狀、液泡化程度、胞質(zhì)含量、細(xì)胞壁特性等具有很大的差異。

細(xì)胞再分化

已脫分化的組織或細(xì)胞具較大的可塑性，在特定的離體條件下，重新恢復(fù)細(xì)胞分化能力，形成各種不同類型細(xì)胞的過程。

細(xì)胞脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。是指已分化的細(xì)胞失去其分化特征，恢復(fù)到分生組織狀態(tài)，即胚性細(xì)胞狀態(tài)。外植塊：當(dāng)繼代培養(yǎng)時，將原培養(yǎng)物切割或不切割轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中的材料，稱為～胚性細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成完整植株分裂分化生長成熟細(xì)胞分生細(xì)胞多細(xì)胞團(tuán)形態(tài)建成完整植株分化：脫分化：脫分化分裂再分化生長1、分化過程：三個時期－誘導(dǎo)期、分裂期和分化期。、誘導(dǎo)期(啟動期)：是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期

細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：

核擴(kuò)大并移至細(xì)胞中央，染色體和核仁改變，核糖體變密集，RNA迅速合成和積累，胞質(zhì)變濃，大液泡解體，細(xì)胞恢復(fù)到具分裂能力的狀態(tài)－－成為胚性細(xì)胞。

時間：多為一天至數(shù)天。菊芋－－22h（未儲存）；－－44h(儲存后)胡蘿卜－－96h

、分裂期：細(xì)胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時期

整體變化：

外層細(xì)胞迅速分裂，細(xì)胞體積變小并回復(fù)到分生組織狀態(tài)，稱回復(fù)變化。細(xì)胞數(shù)目增加，體積最小。

細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化：細(xì)胞核和核仁最大，DNA含量最高，RNA含量持續(xù)上升、分化期：愈傷組織形成到器官發(fā)生時期

停止分裂的細(xì)胞發(fā)生生理代謝變化－愈傷組織－－細(xì)胞分化－－組織分化－－器官分化。

變化：a、各種酶活性增強(qiáng)RNA聚合酶活性－－RNA和組蛋白合成增強(qiáng)；淀粉酶活性——淀粉積累——根、芽分化提供能量。b、培養(yǎng)物中分化出擬分生組織和維管組織——導(dǎo)致器官原基的形成。

擬分生組織（分生組織結(jié)節(jié)）：

生長的愈傷組織中出現(xiàn)的類似分生組織的細(xì)胞群，其細(xì)胞體積小，壁薄，液泡小，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色深?？梢杂梢粋€或幾個細(xì)胞形成。、植株再生的途徑兩種途徑：a、根芽器官直接分化形成植株－器官發(fā)生途徑。可以先長芽后長根（常見），或相反（少見）b、產(chǎn)生具胚芽、胚根的胚狀體結(jié)構(gòu)再形成植株－體細(xì)胞胚胎發(fā)生。2、分化條件、影響脫分化的因素：a、生理或機(jī)械隔離：

脫離有機(jī)體，使細(xì)胞脫離了整體影響；機(jī)械隔離使外植體受到損傷，發(fā)生應(yīng)激性反應(yīng)，產(chǎn)生生化響應(yīng)，發(fā)生呼吸活性、氣體交換率、代謝物含量等一系列變化，均對脫分化產(chǎn)生影響。b、培養(yǎng)細(xì)胞的異質(zhì)性：

已分化的不同類型細(xì)胞之間存在很大的異質(zhì)性，如生理狀態(tài)不同、染色體倍數(shù)性不同等。c、生長調(diào)節(jié)劑的影響：

生長素－2,4-D是啟動細(xì)胞分裂的重要因素。d、光線的影響:

光線對脫分化過程有一定影響。如：暗光切取的外植塊，進(jìn)行暗培養(yǎng)有利于脫分化。外植塊脫分化愈傷組織再分化體細(xì)胞胚器官分化單極器官先莖后根具根莖的兩極器官先根后莖植株外植體脫分化與再分化形成完整植株的途徑：、影響維管形成組織分化的因素?zé)o論是植物活體還是離體條件下，細(xì)胞分化研究的重點(diǎn)是維管組織分化，特別是木質(zhì)部分化。a、生長調(diào)節(jié)劑：

生長素對維管組織分化過程有顯著影響。*低濃度－－能刺激木質(zhì)部發(fā)生，即，生長素濃度與木質(zhì)部發(fā)生頻率之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。*細(xì)胞分裂素－－主要對生長素起協(xié)調(diào)和增效作用。b、糖類物質(zhì)：生長素對維管組織分化的作用，取決于糖的存在。蔗糖濃度與分化作用成正比。二、植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生（一）、體細(xì)胞胚胎發(fā)生特點(diǎn)

表現(xiàn)在：

1、胚狀體是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物

因此胚胎發(fā)生能力是培養(yǎng)的植物細(xì)胞具有的一個基本特征。

2、胚狀體起源于非合子細(xì)胞3、胚狀體發(fā)育過程與合子胚相似

同樣經(jīng)歷球形期、心型期、魚類期和子葉期階段。

鑒別胚狀體的標(biāo)準(zhǔn)1、胚狀體具雙極性

在方向相反的兩端分化出莖端和根端。2、在組織學(xué)上，胚狀體的維管組織與母體植物或外植體的維管組織通常沒有聯(lián)系，胚狀體維管組織呈獨(dú)立的“Y”字形。

誘導(dǎo)體細(xì)胞胚具有顯著特點(diǎn)1、具雙極性

體細(xì)胞胚發(fā)生早期就具有胚根和胚芽兩極，發(fā)育過程與合子胚相似，形成小植株。可以將發(fā)育至一定時期的體細(xì)胞胚制作成人工種子。2、生理隔離

體細(xì)胞胚與外植體的維管束系統(tǒng)聯(lián)系較少－－生理隔離。3、遺傳性相對穩(wěn)定體細(xì)胞胚形成再生植株較器官發(fā)生途徑形成植株變異性小。4、重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特征體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是細(xì)胞全能性表達(dá)最完全的一種方式。（二）、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑(5種)胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接的發(fā)生，分為五種。1、直接從器官外植體上發(fā)生經(jīng)表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體表面已分化細(xì)胞脫分化均可產(chǎn)生胚狀體。2、愈傷組織發(fā)生最常見的形式。表面、內(nèi)部都可產(chǎn)生胚狀體。

胚性細(xì)胞團(tuán)（EC）：愈傷組織中產(chǎn)生的體積小、液泡小、胞質(zhì)濃的細(xì)胞團(tuán)，稱～3、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生形成胚狀體的數(shù)量大4、單倍體細(xì)胞發(fā)生指小孢子或大孢子細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。5、原生質(zhì)體發(fā)生植物原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁經(jīng)分裂所產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)也可形成胚狀體。（三）、體細(xì)胞胚胎的起源體細(xì)胞胚胎起源于單細(xì)胞還是多細(xì)胞？

體細(xì)胞胚發(fā)生的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞分化－－細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)部分基因開放，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的表達(dá)。

絕大多數(shù)體細(xì)胞胚起源于單細(xì)胞。

單個胚性細(xì)胞具有明顯的極性，第一次分裂多為不均等分裂；頂細(xì)胞－－多細(xì)胞原胚基細(xì)胞－－胚柄

極性獲得的誘導(dǎo)因子是植物激素和外界刺激；極性建立對細(xì)胞分化和體細(xì)胞胚發(fā)生具有重要作用。（四）、體細(xì)胞胚胎的生殖隔離生理隔離是體細(xì)胞胚發(fā)生的先決條件※胚性細(xì)胞能否進(jìn)一步分化和發(fā)育形成體細(xì)胞胚，、培養(yǎng)誘導(dǎo)條件的影響；

、細(xì)胞間的相互作用與競爭※只有能夠從周圍細(xì)胞獲得能量、物質(zhì)、和信息的胚性細(xì)胞才能繼續(xù)分裂和分化，并能盡快和周圍細(xì)胞分開，脫離整體控制，相關(guān)基因得到表達(dá)，實(shí)現(xiàn)胚胎發(fā)生的全能性，完成胚胎發(fā)育的全過程。（五）、體細(xì)胞胚胎的遺傳穩(wěn)定性和變異性只有未畸變的細(xì)胞才能形成體細(xì)胞胚－－通過體細(xì)胞胚形成的植株是相對穩(wěn)定的?！泊嬖谧儺悾盒←溣着邽橥庵搀w－后代廣泛變異寧夏枸杞葉－染色體變異煙草、伊貝母、白蘭瓜等－染色體變異頻率與培養(yǎng)材料繼代次數(shù)呈正相關(guān)。※細(xì)胞分裂過程：DNA復(fù)制－染色體復(fù)制－細(xì)胞核復(fù)制－細(xì)胞復(fù)制和分裂。任何一步受阻或異常，都將導(dǎo)致染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異。三、影響植物細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的因素影響因素有：

外因－－培養(yǎng)植物細(xì)胞的培養(yǎng)基和環(huán)境條件

內(nèi)因－－植物細(xì)胞的遺傳性和生理狀態(tài)（一）、培養(yǎng)基及環(huán)境條件1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)類物質(zhì)對離體條件下的植物細(xì)胞形態(tài)的發(fā)生具有很大影響。

根和芽的分化取決于生長素與細(xì)胞分裂素類的比值（控制器官分化的激素模式）；有時器官分化也取決于其絕對濃度。外植體脫分化形成愈傷組織再分化分化成芽分化成根完整植株低細(xì)胞動素/生長素高細(xì)胞動素/生長素高生長激素（2,4-D）激素控制器官分化的模式圖、培養(yǎng)基中的生長類激素生長素作用分兩個階段a、生長素（主要是2,4-D）對愈傷組織的誘導(dǎo)及胚胎發(fā)生叢的形成是必不可少的。－－愈傷組織增殖，但不能發(fā)育成熟（我們稱含有生長素培養(yǎng)基為體細(xì)胞胚胎發(fā)生的“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”）b、降低2,4-D濃度，相對提高細(xì)胞分裂素與生長素的濃度－－分生區(qū)細(xì)胞分裂，形成胚胎發(fā)育條件。

（第二階段要將培養(yǎng)物移至無生長素或的濃度生長素的培養(yǎng)基中）、培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分

培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分對器官分化和胚狀體發(fā)生具有很大影響。*生根培養(yǎng)基－無機(jī)離子濃度小，如：減半的MS培養(yǎng)基。*促進(jìn)器官分化－提高培養(yǎng)基中無機(jī)磷含量；提高AA、嘌呤、嘧啶類物質(zhì)。*其他：糖的濃度可以影響器官分化和胚狀體的發(fā)生發(fā)育；氮源對胚胎發(fā)生有重大影響。、培養(yǎng)基的物理性質(zhì)

滲透壓、pH、固態(tài)或液態(tài)等都對細(xì)胞形態(tài)發(fā)生有影響。*糖對滲透壓起決定作用，其次是甘露醇、鹽類。*pH范圍：5.6－6.0*固、液態(tài)要視不同培養(yǎng)物的情況而定。如：胡蘿卜在固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織；在液態(tài)培養(yǎng)基上增殖和產(chǎn)生胚狀體。2、環(huán)境條件光照和溫度對器官發(fā)生和胚狀體形成有較大的影響。*光對細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的作用是一種誘導(dǎo)反應(yīng)包括光強(qiáng)、光周期和光質(zhì)。通常1000—1500lx*光質(zhì)：

紅光－有利于生根紫外光和藍(lán)光－－有利于芽發(fā)生*溫度：一般采用25℃（二）、培養(yǎng)材料生理?xiàng)l件1、器官組織類型

不同種植物的器官組織產(chǎn)生的愈傷組織器官分化明顯不同。（由材料的基因型決定）。如：煙草、胡蘿卜等易誘導(dǎo)器官形成；棉花、豆類則較難。2、個體發(fā)育年齡

外植體幼嫩比較容易誘導(dǎo)形成愈傷組織。3、愈傷組織生理狀態(tài)

愈傷組織繼代次數(shù)越多，器官分化能力越低。

第二節(jié)、植物離體無性繁殖

離體無性繁殖是植物是目前植物組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)最多、最廣泛和最有效的實(shí)例。

利用鱗莖、球莖、塊根等營養(yǎng)器官繁殖的植物，可以保持原植物品種優(yōu)良特征，繁殖率極高。具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。一、植物離體無性繁殖的概念和意義（一）、植物離體無性繁殖的概念

植物離體繁殖：（簡稱離體繁殖、微型繁殖或快速無性繁殖）利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行植物離體培養(yǎng)，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致個體的方法。

試管苗：離體無性繁殖獲得的植株稱~。（二）、植物離體無性繁殖的意義1、繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高一個外植體一年可以繁殖數(shù)以萬計(jì)的苗木。2、占用空間小，不受季節(jié)限制，便于工廠化育苗一間30m2的培養(yǎng)室，可以同時存放1萬多個瓶子。3、繁殖各種珍稀、瀕危苗木和突變體，為育種服務(wù)。二、植物離體無性繁殖中的器官

發(fā)生方式植物離體無性繁殖中器官發(fā)生方式有5種（一）、不定芽型

指選取具有頂芽和腋芽的短枝無菌培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)成苗（枝條）或增殖產(chǎn)生許多不定芽發(fā)育成苗，最后再生根形成植株。

特點(diǎn)：、繁殖率高。、能保持該種植物的遺傳穩(wěn)定性。、可使繁殖周期長的林木縮短其童年期。

（二）、器官型

指直接從莖、葉、鱗片等外植體上誘導(dǎo)不定芽或帶芽的休眠器官（如小鱗莖、小球莖、小塊莖）產(chǎn)生，再生成植株的方式。

特點(diǎn)：、繁殖率非常高但繁殖速度較慢、遺傳性穩(wěn)定（三）、器官發(fā)生型指誘導(dǎo)器官外植體產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)分化培養(yǎng)形成芽、根或胚狀體再生成植株的方式。

特點(diǎn)：、繁殖速度較快、培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織階段再生成植株，遺傳性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生變異。、愈傷組織是遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)或原生質(zhì)體培養(yǎng)的良好材料。（四）、胚狀體發(fā)生型指植物器官、組織和細(xì)胞外植體經(jīng)培養(yǎng)脫分化形成胚狀體再成苗的方式。特點(diǎn)：、胚狀體發(fā)生數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、繁殖系數(shù)高、遺傳性穩(wěn)定。（五）、原球莖型是蘭屬特有的器官發(fā)生方式，即外植體經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生原球莖，再直接長成植株。一個蘭花莖尖經(jīng)一年反復(fù)誘導(dǎo)培養(yǎng)可產(chǎn)生400萬株蘭花苗。三、植物離體無性繁殖方法和

影響因素（一）、植物離體無性繁殖方法1、母株制備母株－用于發(fā)生離體培養(yǎng)無性系的植物材料。

技術(shù)關(guān)鍵：、材料滅菌－－根據(jù)不同材料采用不同的消毒方式。、培養(yǎng)基篩選－－離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵2、增殖指繁殖體的增殖階段。是快速繁殖過程最主要的階段。

關(guān)鍵：、選擇一條最適合該外植體的途徑。、適合培養(yǎng)基的選擇、適宜的激素種類及濃度配比注：芽增殖時，外源激素的積累可導(dǎo)致畸形芽的產(chǎn)生－－調(diào)整激素濃度。3、植株再生及鑒定將繼代增殖的小芽（苗），轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)根分化，最終形成具根、莖、葉的完整小植株的過程，稱植株再生。

關(guān)鍵：、培養(yǎng)基是根分化的技術(shù)關(guān)鍵。、高水平的生長素（極少用2,4-D），低水平細(xì)胞分裂素或僅有生長素即可。、難生根－－生長素加黑暗。

鑒定－細(xì)胞學(xué)和形態(tài)學(xué)等方法檢查再生植株是否有遺傳變異。4、煉苗和移植

讓試管苗適應(yīng)自然環(huán)境的過程，稱煉苗。煉苗馴化過程要逐步過渡。

移栽、將小苗基部培養(yǎng)基沖洗干凈－避免有害微生物侵害。、移植小苗的基質(zhì)同上述生根培養(yǎng)基質(zhì)，應(yīng)用前消毒。、注意保濕，空氣濕度為70％－90％。（二）、植物離體無性繁殖的影響因素外植體誘導(dǎo)、增殖、分化過程產(chǎn)生完整植株是一復(fù)雜過程受眾多因素影響。1、培養(yǎng)基選擇適宜的培養(yǎng)基、激素以及其他添加物。如：大多數(shù)植物－－MS培養(yǎng)基LS、SH等也可。

激素：

細(xì)胞分裂素1－2mg/L；6-BA為首選。生長素0.1－1mg/L；NAA、IBA。誘導(dǎo)愈傷組織或體細(xì)胞胚胎發(fā)生選用2,4-D。2、培養(yǎng)條件

離體無性繁殖與溫度、光照、濕度等密切相關(guān)。*溫度：25＋2℃，一般不低于15℃，不高于35℃*光照：1000～1500lx每天16h光照，8h黑暗*濕度：培養(yǎng)器內(nèi)的濕度為100％；一般保持在70％～90％3、外植塊外植體取材幾乎包括植株的各個部位，不同種類植物及同種植物不同外植體誘導(dǎo)率又很大差別。因此，應(yīng)綜合考慮。如：材料來源、組織、器官類型、外植體大小、生理年齡等因素。第三節(jié)、無病毒植物培養(yǎng)20世紀(jì)50年代初，Morel發(fā)現(xiàn)用根尖培養(yǎng)方法，從嚴(yán)重感染病毒的大麗花植株得到無病毒苗。一、病毒在植物體內(nèi)的分布及危害（一）、病毒在植物體內(nèi)的分布葉片（達(dá)到一定濃度）－－韌皮部－－隨維管束大范圍轉(zhuǎn)移到植株其他部位。

*老葉和成熟組織及器官中病毒含量高；

*幼嫩和未成熟的組織和器官中病毒含量低。（二）、病毒對植物的危害無性繁殖的植物，都易受到一種或多種病毒的侵害。

感染途徑：營養(yǎng)體、刀具、土壤等傳遞給后代。

種類：植物病毒超過500種。注：病毒危害與真菌和細(xì)菌不同，不能通過化學(xué)殺菌劑和抗生素進(jìn)行防治和消除。因而只能用脫毒的方法。（三）、植株脫病毒的意義1、植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程的重要組成部分2、脫毒種苗的生產(chǎn)可以提高作物質(zhì)量和產(chǎn)量。3、脫毒育苗可以防止品種退化問題。4、可以減少農(nóng)藥的施用，防止病害的蔓延與擴(kuò)散。二、植物脫病毒方法主要有物理方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法。（一）、物理方法：1、高溫處理（溫?zé)岑煼ǎ?/p>

原理：V受熱后不穩(wěn)定，活性鈍化，繁殖能力降低，失去侵染能力；而植物細(xì)胞分裂加速，不受高溫傷害。

方法：溫湯浸漬處理和熱風(fēng)處理、溫湯浸漬處理：

適于切下的休眠組織材料。方法：

50℃左右的溫水中浸漬材料數(shù)分鐘至數(shù)小時（達(dá)55℃，大多數(shù)植物材料被殺死。）熱風(fēng)處理：適于生長組織方法：

將生長的盆栽植物材料在35℃～40℃的生長箱或室內(nèi)處理數(shù)十分鐘或長達(dá)數(shù)月；切取處理后新長出的枝條作接穗。2、低溫處理（冷療法）如：

菊花矮化病毒（CSV）和菊花褪綠斑駁病毒（CCMN）的植株，經(jīng)5℃處理4個月，獲得67％的去CSV無病毒苗、22％去CCMN無病毒苗。（二）、化學(xué)方法

利用化學(xué)藥品處理：

嘌呤和嘧啶類似物、AA、抗生素等抑制植物體內(nèi)病毒復(fù)制。

常用：孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤（三）、生物方法利用植物根尖、珠心胚、愈傷組織等外植體進(jìn)行培養(yǎng)取出病毒。1、莖尖培養(yǎng)最有效的脫毒方法。注：切取莖尖的大小與脫毒效果有直接的關(guān)系－莖尖越小，去病毒機(jī)會越大。

莖尖通常取材0.2~0.5mm。

原則：既要保證脫毒效果，又要提高外植體成活率。2、微體嫁接法

木本植物不能采用莖尖培養(yǎng)

方法：

將極小的莖尖（0.14~1.0mm）作為接穗嫁接到不帶病毒的種子實(shí)生苗砧木上將砧木、接穗一起在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

應(yīng)用：

蘋果、柑橘、桃等木本植物3、珠心組織培養(yǎng)法柑橘類植物除合子胚外，還有多個珠心胚。珠心組織與維管束系統(tǒng)沒有直接聯(lián)系，故珠心組織培養(yǎng)可獲得無病毒植株。

該方法的缺點(diǎn)：

、有20％～30％左右的變異率。、無病苗的苗期較長。4、愈傷組織脫毒各種器官和組織經(jīng)誘導(dǎo)都可產(chǎn)生愈傷組織，在分化培養(yǎng)產(chǎn)生芽，長成植株。

原理：、V在植物體內(nèi)分布不均，由無V的細(xì)胞產(chǎn)生的愈傷組織是獲得無V苗的基礎(chǔ)。、愈傷組織細(xì)胞V濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞快速分裂的過程中，V的復(fù)制能力衰退或丟失。、繼代培養(yǎng)的愈傷組織中容易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，在人工誘導(dǎo)下，變異更顯著，產(chǎn)生不帶V的愈傷組織。三、脫毒植物檢測及保存（一）、檢測方法1、直接測定法：

直接觀察植株莖、葉等器官有無病害引起的可見癥狀。

缺點(diǎn)：

不夠直接，靈敏。2、指示植物法

原理：利用指示植物對V的敏感性。

發(fā)現(xiàn)：1929年美國病毒學(xué)家Holmes發(fā)現(xiàn)，用已被TMV感染的普通煙葉粗汁液與金剛砂相混，在心葉煙葉子上摩擦，2～3d后，后者葉片上出現(xiàn)局部壞死斑，且在一定范圍內(nèi)，枯斑數(shù)與侵染V濃度成正比。

指示植物（2種）：、在接種V后產(chǎn)生的癥狀可擴(kuò)展到非接種部位、只在接種部位產(chǎn)生明顯的病斑。

方法：、摩擦接種法：處理待檢查的植株葉片的汁液與金剛砂混合－－輕輕摩擦指示植物葉片，使汁液侵入葉片表皮細(xì)胞但不損傷葉片－－用水沖洗葉片－－觀察。、嫁接法：適用于不能通過汁液傳播的。用被鑒定植株芽作接穗，指示植物作砧木－－觀察指示植物。3、抗血清鑒定方法用已知病毒的的抗血清來鑒定未知V的種類。

特點(diǎn)：

簡便、準(zhǔn)確、速度快，（一般幾分鐘至幾小時即可完成）。準(zhǔn)確率高。

方法：

試管沉淀、凝集試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等多種方法。V感染人工注射異體蛋白動物動物血清反應(yīng)帶該種v植物（抗原）（抗體）（抗原）血清鑒定法示意圖4、電鏡檢查法采用電子顯微鏡直接觀察樣品材料有無V感染。

特點(diǎn)：既準(zhǔn)確又有效。

技術(shù)要求高：

超薄切片技術(shù)、背景染色技術(shù)、掃描電鏡等5、分子檢測法

利用已知V的核苷酸序列或同組V的相似序列區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，將待測樣品用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA、隨機(jī)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行分子生物學(xué)方面的分析，從而鑒定是否有病毒感染。

特點(diǎn)：快速、簡便、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。（二）、無病毒原種的保存與繁殖1、無病毒原種的保存

主要是利用隔離法進(jìn)行保存。

注意事項(xiàng)：、隔離區(qū)，最好將原種材料種植保存在網(wǎng)室中，防止昆蟲特別是傳染V的蚜蟲侵入。、種植區(qū)土壤也應(yīng)消毒、防止工具、衣服等接觸傳染V。、定期復(fù)查。2、無病毒原種的繁殖*

關(guān)鍵是防止V再度感染。*建立一整套嚴(yán)格的良種繁殖制度，生產(chǎn)上做好土壤的消毒和防昆蟲工作；保持無V原材料質(zhì)量。*一旦感染，及時替換感病植株。第四節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)

意義：、植物細(xì)胞培養(yǎng)有助于研究植物細(xì)胞的特性和潛力。、了解細(xì)胞間的相互關(guān)系、研究細(xì)胞分化、發(fā)育和形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)理。、細(xì)胞代謝研究，各種不同物質(zhì)對細(xì)胞的影響研究。一、單細(xì)胞分離方法（3種）（一）、機(jī)械法：

是從完整的植物器官中分離單細(xì)胞的方法之一。

優(yōu)點(diǎn)：、細(xì)胞未受酶傷害、有利于進(jìn)行細(xì)胞的生理生化研究。*方法一：研磨法*方法二：搖床振蕩方法，使懸浮培養(yǎng)中疏松易碎的愈傷組織細(xì)胞分散成單細(xì)胞和小細(xì)胞。(二)、酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他組織，使細(xì)胞分離的方法。

注意：酶對細(xì)胞壁有一定的軟化的不良作用，因此，必須加入甘露醇等滲透壓保護(hù)。

優(yōu)點(diǎn)：可以得到較多的葉肉游離細(xì)胞。但對禾本科植物葉片較困難。（三）、化學(xué)法利用一些化學(xué)藥劑游離細(xì)胞的方法。常用：草酸鈣－胡蘿卜；秋水仙素、2,4－D或LH，對分散細(xì)胞均有一定作用。二、單細(xì)胞培養(yǎng)方法和影響因素（一）、培養(yǎng)方法可以分為懸浮培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、微室培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)

將植物