糧食真菌檢驗中的無菌控制

糧食真菌檢驗中的無菌控制

食物是微生物自然營養(yǎng)的集合。谷物不僅存在于糧食表面，也存在于糧食內(nèi)部。隨著糧食由田間轉(zhuǎn)入倉庫,微生物優(yōu)勢菌種類也由田間真菌———交鏈孢霉等慢慢轉(zhuǎn)變?yōu)楦婢购颓嗝沟?。真菌對糧食的品質(zhì)及其儲藏穩(wěn)定性有很大的影響,極易產(chǎn)生代謝產(chǎn)物———黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素等真菌毒素。為了確保測定結(jié)果中的真菌來源于糧食本身,真實反映糧食貯藏過程中的微生物種類和數(shù)量,在檢驗操作過程中應(yīng)對各個環(huán)節(jié)進行必要的無菌控制,采用安全有效的消毒滅菌技術(shù)。糧食中常見的真菌有:交鏈孢霉、根霉、毛霉、白曲霉、鐮刀菌、黃曲霉、棕曲霉、灰綠曲霉、雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉等。而江南溫潤潮濕的氣候條件同樣適合青霉、毛霉和曲霉的生長。隨著塵土從空氣中落到微生物實驗室的各個地方,極易發(fā)生青霉、毛霉等交叉污染。因真菌類微生物菌落較大,一旦形成優(yōu)勢,可以覆蓋整個培養(yǎng)皿。因此,滅菌技術(shù)成為控制檢驗結(jié)果準確的關(guān)鍵,且貫穿于整個檢驗過程,不論哪個環(huán)節(jié)造成污染都會影響測定結(jié)果準確性。在GB4789.1—2010《食品微生物學(xué)檢驗總則》、GB4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》、GB4789.15—2010《霉菌和酵母計數(shù)》國家標準中,對環(huán)境、設(shè)備、器械、實驗材料等的消毒滅菌均未做出詳細說明。因此,根據(jù)實際操作過程中的經(jīng)驗,選擇采用適當(dāng)?shù)南緶缇夹g(shù)就很有必要。1糧食微生物的培養(yǎng)基糧食微生物生長的基質(zhì)是谷物,谷物的含水量較低,一般在11%~15%,長期適應(yīng)在這類基質(zhì)上生長繁殖的微生物,也就適應(yīng)了較高滲透壓的環(huán)境,致使一些主要糧食微生物在普通培養(yǎng)基上不能生長或生長不良。因此,選擇適合糧食微生物生長的培養(yǎng)基是很重要的。在糧食真菌檢驗中我們所采用的培養(yǎng)基是滲透壓較高的,能分離得到較多糧食微生物的改良察氏(Czapek-Dox)培養(yǎng)基,即在察氏培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加60gNaCl。具體配方為:蔗糖30g,NaNO32g,K2HPO41g,MgSO4·H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,瓊脂20g,蒸餾水1000ml。2消毒和消毒為保證在糧食真菌檢驗過程中處于無菌狀態(tài),對各類器具與空間的消毒和滅菌可采用不同的方法。2.1培養(yǎng)基的密封高壓蒸汽滅菌法是將待滅菌的物品放進一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi),通過加熱,使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡后,關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱。此時由于蒸汽不再溢出,可使滅菌鍋內(nèi)的壓力增大,沸點增高,溫度達100℃以上,從而導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。培養(yǎng)基、無菌水、稱量紙的滅菌可采用高壓蒸汽滅菌法。將配好的培養(yǎng)基分裝在500ml三角瓶中,塞好棉塞(用普通棉花外面包紗布用線扎緊);分裝好無菌水(三角瓶225ml和試管9ml);稱量紙外面用油紙包好扎緊,然后進行高壓蒸汽滅菌。此時,滅菌鍋內(nèi)冷空氣排除是否完全極為重要。因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓,當(dāng)水蒸氣中含有空氣時,在同一壓力下,含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。高壓滅菌鍋留有不同分量空氣時,滅菌效果不同。采用在0.10和0.14MPa壓力下,滅菌30min,對500ml三角瓶中培養(yǎng)基高壓滅菌鍋留有不同分量空氣(壓力升至0.05MPa時,放氣閥排出空氣)時的滅菌效果進行比較,在28~30℃恒溫箱培養(yǎng)5d后觀察,培養(yǎng)基污染情況見表1。從表1可以看出,放氣閥排出全部空氣,高壓滅菌鍋壓力升至0.10和0.14MPa,滅菌30min時,培養(yǎng)基均沒有發(fā)生污染情況。因壓力表量程最高為0.14MPa,為安全起見,高壓滅菌采用0.10MPa,121.5℃,30min,可達到徹底滅菌的效果。2.2紫外線照射與化學(xué)藥劑的使用效果無菌室、超凈工作臺、地面、培養(yǎng)箱一般采用波長為200~300nm的紫外線進行殺菌消毒。由于輻射能使空氣中的氧電離成[O],再使氧氣生成臭氧。紫外線穿透力不大,照射距離為1.2m,為了加強紫外線消毒效果,減少紫外線對人體的傷害,同時又能達到滅菌效果,在實驗中采用物理和化學(xué)相結(jié)合的方法進行滅菌。采用單一的紫外線照射與化學(xué)試劑結(jié)合使用作比對,將3個打開的平板培養(yǎng)基分別放置在超凈工作臺、桌面和地面15min后,放入28~30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d后觀察,結(jié)果見表2。由表2可以看出,采用2%~3%來蘇兒(煤酚皂液)和紫外線照射相結(jié)合的消毒方法效果良好,可以增強紫外線滅菌效果,照射時間可從30min減少到15min,減少了臭氧對人體的危害。因此,在打開紫外燈前,先將無菌室內(nèi)的桌面、凳子用2%~3%的來蘇兒擦拭,然后再開紫外燈照射,達到滅菌目的。同時間隔一周時間在無菌室內(nèi)噴灑3%~5%石炭酸溶液,以使空氣中附著微生物的塵埃落下并殺死一部分細菌,增強滅菌效果。培養(yǎng)箱同等操作。在無菌室紫外消毒時將工作衣、帽進行消毒,雙手用75%酒精消毒,避免因人為因素造成的污染。2.3實驗方法不同高溫能使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時,當(dāng)環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大,則蛋白質(zhì)凝固就越快,反之含水量越少,凝固越緩慢。因此,與濕熱滅菌相比,高溫干熱滅菌所需溫度要高,時間要長。將培養(yǎng)皿(10個一卷)、吸量管(1、10ml,距管口3cm處塞1.5cm左右棉花,松緊適度)、試管分別用報紙包好,放入電烘箱中160℃滅菌2h,溫度不能超過180℃,否則報紙會被烤焦,引起燃燒。當(dāng)溫度下降到70℃以下再將物體取出。將培養(yǎng)基倒在160℃高溫滅菌2h后的培養(yǎng)皿上,經(jīng)28~30℃培養(yǎng)5d后觀察,結(jié)果為陰性。2.4日常檢測結(jié)果各類器具與空間按照上述不同的方法進行消毒滅菌,在每次檢測樣品時做2個空白培養(yǎng)皿進行效果評價,通過多次日常檢測觀察,結(jié)果見表3。由表3可知,用以上滅菌技術(shù)控制檢驗過程,可以達到良好的無菌效果。3火焰旁進行在緩沖室內(nèi),用滅菌稱量紙迅速稱取25g糧食樣品到裝有225ml無菌水中,振蕩30min,在超凈工作臺上進行無菌操作。注意身體不要靠著超凈工作臺,整個過程都在火焰旁進行。先將培養(yǎng)皿和試管進行編號,吸取樣液10ml至試管中,另用1ml吸管反復(fù)吹吸混勻;取稀釋倍數(shù)10-1、10-2、10-3各1ml,分別接入相應(yīng)標號的培養(yǎng)皿中,每個稀釋度接2個培養(yǎng)皿,待瓊脂冷卻到45℃時(用手背試感到不燙手)倒入約15~20ml左右,馬上搖勻冷卻,倒置,于28~30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7d,觀察。4真菌形態(tài)鑒定選擇菌落數(shù)在10~150個之間稀釋度培養(yǎng)皿的背面劃十字,按區(qū)域分別計數(shù)后相加,根據(jù)稀釋倍數(shù)計算菌落總數(shù),以獲得活菌的信息和污染程度。根據(jù)菌落形態(tài)、大小、色澤、邊緣、菌絲和子囊殼等特征,判斷真菌的屬性,如果不能確定,取出載玻片在酒精燈上消毒,滴加一滴乳酸苯酚固定液,接種針在酒精燈上消毒,然后在無菌的培養(yǎng)基中冷卻一下,蘸取一點菌體涂在固定液上,蓋上蓋玻片,防止氣泡,置于低倍鏡和高倍鏡下觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)特征,重點觀察菌絲是否分隔,曲霉和青霉的分生孢子形成特點,對根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子進行鑒定,繪圖。檢驗用過的平板也要經(jīng)高壓滅菌后再行處理,防止交叉感染。5培養(yǎng)基的使用(1)選擇正確的滅菌消毒方法及規(guī)范的操作是糧食真菌檢驗的關(guān)鍵,按上述控制方法進行操作可以達到良好的無菌效果。(2)高溫干熱滅菌時,電烘箱內(nèi)物品不要擺得太擠,以免妨礙空氣流通,滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板,滅菌溫度不能超過180℃,以防包裝紙烤焦起火。在保持160℃,2h恒溫時,嚴防恒溫調(diào)節(jié)自動控制失靈而造成安全事故。待溫度下降到70℃后再取出物品。如出現(xiàn)冒煙現(xiàn)象,切忌打開烘箱門,避免燃燒。(3)培養(yǎng)基三角瓶分裝,