毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定蛛香根中主要生物活性成分的含量

毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)法測(cè)定蛛香根中主要生物活性成分的含量

1生物活性物質(zhì)蜘蛛虱子。其入藥部分一般為干燥根莖,具有鎮(zhèn)靜安神、理氣止痛、祛風(fēng)除濕、消炎止瀉等功效,可用于治療脘腹?jié)q痛,消化不良,腹瀉,痢疾,風(fēng)濕痹痛,腰膝酸軟等病癥。對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行的大量研究發(fā)現(xiàn),環(huán)烯醚萜類、黃酮類和酚酸類化合物是其主要的生物化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明,黃酮類化合物能預(yù)防癌癥,咖啡酸和綠原酸等酚酸類物質(zhì)則具有抗氧化性、抗誘變性和抗癌活性。目前,蜘蛛香中揮發(fā)性成分、脂肪酸和萜類化合物等成分的檢測(cè),主要有薄層掃描法、GC-MS、高效液相色譜法和氣相層析-質(zhì)譜聯(lián)用等方法。毛細(xì)管電泳(CE)具有分離效率高、分析速度快、重現(xiàn)性好、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn),是一種高效的分離分析技術(shù)。與電化學(xué)檢測(cè)方法聯(lián)用,CE-ED對(duì)電活性物質(zhì)具有很高的靈敏度和選擇性。本研究首次采用CE-ED,分別測(cè)定了不同產(chǎn)地蜘蛛香根中香葉木素、山奈酚、芹菜素、綠原酸以及咖啡酸等5種多元酚類化合物,建立了一種分離檢測(cè)蜘蛛香根中活性成分的簡(jiǎn)便、可靠、靈敏的新方法。2實(shí)驗(yàn)部分2.1毛細(xì)管、工作電極的組裝毛細(xì)管電泳電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)(CE-ED)為自組裝。包括±30kV高壓電源(中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所);BASLC-4C安培檢測(cè)器(美國(guó)生物分析系統(tǒng)公司);EB100型臺(tái)式單筆記錄儀(上海大華儀表廠);Model14901三維微定位器(斯特拉特福,美國(guó)康涅狄格州);75cm長(zhǎng)熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑25μm,外徑360μm,河北永年銳灃色譜器件有限公司);毛細(xì)管、檢測(cè)池和三電極體系均組裝在一個(gè)帶有微動(dòng)開關(guān)的樹脂玻璃框架中,以保證儀器和操作人員的安全。當(dāng)框架打開時(shí),微動(dòng)開關(guān)會(huì)自動(dòng)切斷電源。工作電極為300μm的碳圓盤電極,使用前先用金相砂紙拋光,并置于二次蒸餾水中超聲清洗5min,然后借助三維微定位器,使工作電極與毛細(xì)管出口在一條直線上,并盡可能靠近毛細(xì)管的末端。鉑絲為輔助電極,飽和甘汞電極為參比電極。用BASLC-4C安培檢測(cè)器檢測(cè)氧化電流,電泳圖譜由單筆記錄儀記錄。采用電遷移進(jìn)樣,使用16kV電壓從毛細(xì)管陽極端進(jìn)樣8s,檢測(cè)池為陰極電泳池。2.2樣品的配制和過濾山奈酚、芹菜素、綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司;香葉木素購自中國(guó)藥品生物制品檢定所。5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均為1.00×10-3g/mL,用無水乙醇(分析純)配置,避光4℃保存。其它不同濃度的工作液,用運(yùn)行緩沖液(pH值8.7～9.5,濃度為50.0mmol/L的硼砂溶液)稀釋得到。所有分析樣品均經(jīng)0.22μm聚丙烯濾膜過濾后進(jìn)樣。四川蜘蛛香根由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院提供,貴州蜘蛛香根購自貴陽市藥店。2.3超聲萃取-濾紙過濾將兩種產(chǎn)地蜘蛛香的根磨成粉狀,分別準(zhǔn)確稱取2.0g,用10mL、80%乙醇溶液∶去離子水=4∶1(V/V)超聲萃取1h后,先用濾紙過濾,再用0.22μm聚丙烯濾膜過濾,將得到的濾液放于陰暗處保存。3結(jié)果與討論3.1所需的電泳條件3.1.1種組分的電化學(xué)特性電化學(xué)檢測(cè)是基于被測(cè)物質(zhì)能夠在碳電極上發(fā)生電化學(xué)氧化的性質(zhì)。上述5種組分由于帶有酚羥基,均具有較好的電化學(xué)活性,且電極電位直接影響被分析物的電化學(xué)響應(yīng),因此為了選擇最佳工作電位,對(duì)5種組分的流體伏安曲線進(jìn)行了測(cè)定(如圖1)。當(dāng)電極電位超過+500mV(vs.SCE)時(shí),5種組分均產(chǎn)生氧化電流。隨著電極電位的增大,香葉木素和芹菜素的氧化電流增加迅速,而其它3組分的響應(yīng)受氧化電位影響較小。當(dāng)電極電位大于+950mV時(shí),雖然香葉木素和芹菜素的氧化電流仍稍有增加,但此時(shí)本底電流大幅增加,噪音明顯提高,而導(dǎo)致基流不穩(wěn)。所以選擇檢測(cè)電位為+950mV(vs.SCE),此時(shí)信噪比較高,電極的穩(wěn)定性好。3.1.2緩沖液ph值對(duì)遷移時(shí)間的影響在堿性溶液中,硼酸鹽能與待測(cè)物螯合生成配位陰離子來增加溶解度,減少了因吸附造成的峰拖尾等影響,所以選用硼砂作為緩沖體系。如圖2所示,在pH8.7～9.5范圍內(nèi)5種組分隨著pH值的提高,遷移時(shí)間明顯延長(zhǎng),且pH值為9.2～9.5時(shí),5組分可實(shí)現(xiàn)基線分離。當(dāng)pH值低于9.00時(shí),綠原酸與山奈酚不能實(shí)現(xiàn)分離,而pH值過高會(huì)導(dǎo)致待測(cè)物被氧化。故選擇緩沖溶液的酸度為pH9.23。此時(shí)被測(cè)物可以完全分開,且分析時(shí)間較短。毛細(xì)管內(nèi)壁的zeta電位與運(yùn)行緩沖液的pH值和濃度或離子強(qiáng)度有關(guān)。在固定的pH值下,有效zeta電位隨著緩沖液濃度的增加而降低,從而降低了電滲流,使遷移時(shí)間變長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)在pH9.23、緩沖溶液濃度20.0～100.0mmol/L范圍內(nèi),研究了運(yùn)行緩沖液濃度對(duì)被測(cè)物遷移時(shí)間的影響,最佳緩沖液濃度為50.0mmol/L。3.1.3進(jìn)樣時(shí)間的選擇在一定的毛細(xì)管長(zhǎng)度下,分離電壓決定電場(chǎng)強(qiáng)度。而電場(chǎng)強(qiáng)度影響電滲流速度和荷電物質(zhì)遷移率,繼而決定了分析物的遷移時(shí)間。分離電壓越高,5組分遷移時(shí)間越短。當(dāng)分離電壓超過18kV時(shí),實(shí)際樣品中待測(cè)物不能與其它物質(zhì)達(dá)到基線分離,且基底噪音增大。因而,選擇16kV為最佳分離電壓,在23min中內(nèi)所有組分即可得到很好的分離。進(jìn)樣時(shí)間決定分析樣品的進(jìn)樣量,影響峰電流和峰形。在16kV下,研究了2～12s范圍內(nèi)進(jìn)樣時(shí)間對(duì)進(jìn)樣量的影響。峰電流隨著進(jìn)樣時(shí)間的增加而增加(如圖3)當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于8s時(shí),峰高趨于穩(wěn)定,但峰擴(kuò)展明顯。故在此實(shí)驗(yàn)中,選擇8s(16kV)作為最佳進(jìn)樣時(shí)間。在優(yōu)化條件下,香葉木素、綠原酸、山奈酚、芹菜素和咖啡酸在23min內(nèi)即可達(dá)到基線分離,所得標(biāo)準(zhǔn)溶液的電泳圖譜見圖4(A)。3.2重建、線性和檢出限3.2.1進(jìn)樣及重現(xiàn)性在上述優(yōu)化條件下,將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液(每種標(biāo)準(zhǔn)品的濃度均為2.0mg/L)連續(xù)進(jìn)樣7次,重現(xiàn)性良好。峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)按照出峰次序分別為:1.1%(香葉木素)、3.7%(綠原酸)、2.2%(山奈酚)、1.3%(芹菜素)和3.0%(咖啡酸)。3.2.2咖啡酸的線性范圍在最佳分離檢測(cè)條件下,對(duì)一系列不同濃度(5.0×10-4～0.2g/L)的各組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,要分別測(cè)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),香葉木素、山奈酚與芹菜素的濃度與電泳峰電流在5×10-4～0.1g/L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系;綠原酸與咖啡酸的濃度與電泳峰電流在1×10-3～0.1g/L范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。以y表示峰電流(nA),x表示樣品濃度(g/mL),線性回歸方程分別為y=1.70×105x+0.07(香葉木素,r=0.9994);y=8.90×104x-0.16(綠原酸,r=0.9991);y=1.39×105x-0.10(山奈酚,r=0.9995);y=3.10×105x-0.10(芹菜素,r=0.9998)和y=9.21×104x+0.07(咖啡酸,r=0.9994)。以信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)濃度確定檢出限分別為3.8×10-5g/L(香葉木素)、2.0×10-4g/L(綠原酸)、4.6×10-5g/L(山奈酚)、1.9×10-5g/L(芹菜素)和1.0×10-4g/L(咖啡酸)。3.3標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)化合物中未檢出咖啡酸在選定的測(cè)定條件下,對(duì)四川和貴州蜘蛛香樣品中的5種組分進(jìn)行了測(cè)定,電泳圖譜見圖4(B)和(C)。與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)電泳圖4(A)相對(duì)照,四川產(chǎn)蜘蛛香的根中確實(shí)含有香葉木素(1)、綠原酸(2)、山奈酚(3)、芹菜素(4)和咖啡酸(5);而產(chǎn)自貴州的蜘蛛香根中未檢出咖啡酸。測(cè)定結(jié)果見表1。以州蜘蛛香的根進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法,3次測(cè)得的回收率均在97%～104%之間,平均回收率和相對(duì)偏差(RSD)分別為香葉木素(98.6