第三章 遺傳物質(zhì)的復(fù)制

1中心法則

(TheCentralDogma)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制SmallRNA2第三章遺傳物質(zhì)的復(fù)制

3第一節(jié)核酸復(fù)制的特征

第二節(jié)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)因子

第三節(jié)原核生物的復(fù)制機(jī)理

第四節(jié)病毒基因組復(fù)制的多樣性

第五節(jié)真核生物的DNA復(fù)制

第六節(jié)復(fù)制的忠實(shí)性41、按照堿基配對(duì)原則，以現(xiàn)有的DNA鏈為模板合成新拷貝；部分DNA是以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄的結(jié)果；2、核酸的生物合成只能從5’3’方向進(jìn)行；3、特異的聚合酶類催化核酸的生物合成；4、聚合酶的底物核苷酸是5’-NTP或5’-dNTP；5、DNA聚合酶不能催化從頭開始合成DNA，必需具有引物。第一節(jié)核酸復(fù)制的特征一、核酸生物合成的一般規(guī)則5二、復(fù)制可能的幾種方式圖3-1三種不同的復(fù)制模型6圖3-2Meselson-Stahl實(shí)驗(yàn)（a)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋（b)CsCl梯度離心實(shí)驗(yàn)（c)離心后DNA的吸收值Meselson-Stahl密度標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證實(shí)(1)7

圖3-3Taylor蠶豆根尖放射自顯影實(shí)驗(yàn)。

(a)按半保留復(fù)制預(yù)期DNA在復(fù)制過程中標(biāo)記情況；(b)實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色體放射自顯影的圖示。半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證實(shí)(2)8半保留復(fù)制（Semi-conservativeReplication）

DNA復(fù)制是分別以親代螺旋雙鏈中的一條為模板合成其互補(bǔ)鏈，由此產(chǎn)生的兩條子代雙螺旋都是由一條親代鏈和一條新合成鏈組成，因此稱做半保留復(fù)制。9

三、復(fù)制子、復(fù)制起始點(diǎn)與終止點(diǎn)1、復(fù)制子（replicon）:

1）復(fù)制子是基因組中

DNA分子的復(fù)制單位；2）復(fù)制子含有控制復(fù)制起始的特定位點(diǎn)，即復(fù)制起始點(diǎn)，以及控制復(fù)制終止的終止點(diǎn)。因此復(fù)制子是從復(fù)制起點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域；3）細(xì)菌染色體、質(zhì)粒、病毒只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，整個(gè)DNA分子構(gòu)成一個(gè)復(fù)制子；真核生物染色體有多個(gè)起始點(diǎn)，含多個(gè)復(fù)制子。10Table1

EukaryoticrepliconsaresmallandreplicatemoreslowlythanbacterialDNA．112、復(fù)制起點(diǎn)(origin)1）原核生物的復(fù)制起點(diǎn)特征：通常富含A/T堿基對(duì)，常見回文序列和重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)；復(fù)制起點(diǎn)中的順式DNA序列（反向重復(fù)順序）通過與特異的反式作用蛋白質(zhì)因子反應(yīng)激活復(fù)制；原核生物復(fù)制起點(diǎn)常有較固定的堿基順序和結(jié)構(gòu)，不同物種間保守性較高，某些位點(diǎn)的單堿基缺失即可使復(fù)制子失活。

功能：可以起始一個(gè)復(fù)制循環(huán)，并控制起始反應(yīng)的頻率；把完成復(fù)制的染色體分配到子細(xì)胞中去。12

E.coli的復(fù)制起點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)oriC最小功能片段長(zhǎng)度245bp，是含有4個(gè)9bp的反向重復(fù)和3個(gè)13bp的正向重復(fù)的特征DNA序列；這些重復(fù)序列富含A-T，有利于雙鏈解鏈；OriC中含有9-14個(gè)GATC序列，復(fù)制起始前，其中的A被Dam甲基化，則起始點(diǎn)被活化。1314細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的保守性152）真核生物的復(fù)制起點(diǎn)酵母DNA的復(fù)制起點(diǎn)——自主復(fù)制序列（ARS）酵母染色體為多復(fù)制子，但不同的起點(diǎn)使用頻率有差別；復(fù)制起點(diǎn)ARS1：185bps，由A、B1、B2和B3四個(gè)元件組成，這4個(gè)元件為都是ARS1功能所必需；A元件為核心元件，該改變?nèi)魏我粋€(gè)堿基將導(dǎo)致ARS1失活。AnARSextendsfor~50bpandincludesaconsensussequence(A)andadditionalelements(B1-B3).

161、復(fù)制叉（replicationfork）DNA復(fù)制過程中親本雙螺旋DNA兩條單鏈解離的位點(diǎn)，由于雙鏈解離從而呈現(xiàn)叉狀；2、復(fù)制方向

DNA復(fù)制大多為雙向等速進(jìn)行，此外還有不對(duì)稱的雙向復(fù)制（枯草桿菌）和單向復(fù)制（mt

DNA

D-環(huán)式復(fù)制）。

3、復(fù)制速度原核生物DNA復(fù)制速度較快，如E.coliDNA復(fù)制速度大約是105bp/min;真核細(xì)胞的DNA聚合酶活性低，復(fù)制速度約為500-5000bp/min；從多復(fù)制原點(diǎn)同時(shí)開始并雙向復(fù)制。

四、復(fù)制叉與復(fù)制方向17復(fù)制叉ReplicatedDNAisseenasareplicationeyeflankedbynonreplicatedDNA.18Repliconsmaybeunidirectionalorbidirectional,dependingonwhetheroneortworeplicationforksareformedattheorigin.復(fù)制方向1920五、復(fù)制方式的多樣性1、根據(jù)形態(tài)可分為：1）線形DNA雙鏈的復(fù)制

線性DNA雙鏈的復(fù)制叉生長(zhǎng)方式有單一起點(diǎn)的單向（如腺病毒）及雙向（如T7噬菌體）和多個(gè)起始點(diǎn)的雙向，復(fù)制叉處呈現(xiàn)“眼”型；2）環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制型大腸桿菌DNA復(fù)制中間體就是型，環(huán)狀雙鏈DNA分子復(fù)制時(shí)形成兩個(gè)方向相反的復(fù)制叉；滾環(huán)型一種單向復(fù)制方式，如X174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF）；D-環(huán)型一種單向復(fù)制的特殊形式，兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不重合，各有一復(fù)制起點(diǎn)。動(dòng)物線粒體DNA的復(fù)制采用的就是D-環(huán)型復(fù)制方式。21線形DNA雙鏈的復(fù)制22型復(fù)制DNA從一點(diǎn)開始，單向或雙向復(fù)制，產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)復(fù)制叉，對(duì)一個(gè)線狀分子而言在電鏡下可見“眼狀”結(jié)構(gòu)。對(duì)于環(huán)狀分子而言“眼”的出現(xiàn)是一種“

結(jié)構(gòu)”。2324

X174RF的復(fù)制過程滾環(huán)式復(fù)制

25λ噬菌體DNA的滾環(huán)復(fù)制模型滾環(huán)復(fù)制：在一條鏈上產(chǎn)生一個(gè)缺口，DNA多聚酶延伸這一缺口的3’-OH端，新合成鏈替換原先的親鏈，因?yàn)樵鲩L(zhǎng)點(diǎn)看上去好象在圍著環(huán)狀模板鏈生長(zhǎng)而得名，因而叫做滾環(huán)復(fù)制。因其形狀象希臘字母

，因此又叫

復(fù)制。26D-環(huán)型復(fù)制雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制，但兩條鏈的合成是高度不對(duì)稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的單鏈環(huán)（即D-環(huán)）。272、根據(jù)DNA合成的起始方式

重新起始(denovoinitiation)，子鏈的復(fù)制是重新開始，如復(fù)制叉式復(fù)制；共價(jià)延伸，子鏈?zhǔn)枪矁r(jià)結(jié)合在一條親本鏈上，如滾環(huán)式復(fù)制。28六、半不連續(xù)復(fù)制SemidiscontinuousReplication1、幾個(gè)概念半不連續(xù)復(fù)制

DNA以兩條親本鏈為模板合成子鏈時(shí)，一條子鏈的合成是連續(xù)的，另一條是不連續(xù)的。前導(dǎo)鏈與后滯鏈（leadingandlaggingstrand）DNA雙鏈復(fù)制時(shí)，一條子鏈沿自身5‘→3’方向持續(xù)合成，即前導(dǎo)鏈；而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，即后滯鏈。岡崎片段(Okazakifragment)后滯鏈合成時(shí)，先以親本鏈為模板按5’→3’方向合成出許多1kb-2kb的不連續(xù)片段，被稱做岡崎片段；然后這些短片段共價(jià)聯(lián)結(jié)成一條完整的后滯鏈，后滯鏈的成長(zhǎng)方向與其片段的合成方向相反。292、半不連續(xù)復(fù)制

Theleadingstrandissynthesizedcontinuouslywhilethelaggingstrandissynthesizeddiscontinuously.30第二節(jié)參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)因子

復(fù)制體（replisome）

擔(dān)負(fù)DNA合成的多聚蛋白結(jié)構(gòu)，在復(fù)制叉處裝配。包括了DNA聚合酶和其它酶類。構(gòu)成復(fù)制體的幾種主要酶類及蛋白質(zhì)因子DNA解旋酶（DNAhelicase）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase）單鏈結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA連接酶（DNAligase）DNA引發(fā)酶（DNAprimase）RNaseH31（一）DNA解旋酶（helicase)

DNA雙鏈解旋：該酶沿單鏈DNA移動(dòng)，利用ATP水解獲得能量打斷氫鍵。解旋酶是DNA復(fù)制過程中進(jìn)入復(fù)制體的第一個(gè)組分，是復(fù)制過程中提供單鏈模板所必需的。E.coli的解旋酶由dnaB編碼，是由DnaB蛋白組成的六聚體,

具有5’-3’活性。DnaBDnaC解鏈方向一、超螺旋構(gòu)象變化及解鏈有關(guān)的酶和蛋白32DNA雙鏈解開需要有改變DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的酶；解鏈產(chǎn)生扭曲張力，去除和解離復(fù)制和重組中產(chǎn)生的節(jié)和環(huán)。兩種功能類型：I型拓?fù)洚悩?gòu)酶只剪切一條鏈，作用于含缺口的底物；II型拓?fù)洚悩?gòu)酶同時(shí)切開兩條鏈，可作用于共價(jià)閉環(huán)鏈。（二）DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶331、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I（TopoisomeraseI）1）特點(diǎn)對(duì)超螺旋DNA雙鏈底物，僅切開一條鏈；配對(duì)鏈通過切口及斷端再連接而改變DNA拓?fù)鋺B(tài)，一步反應(yīng)可改變鏈環(huán)數(shù)1;不需要能量，不能除去正超螺旋等需能量的反應(yīng)，對(duì)正超螺旋不敏感；主要在DNA損傷修復(fù)中起作用。

34E.coli的TopoI結(jié)合雙鏈DNA，并切割一條鏈；斷裂的DNA的5’-P端與酶的一條臂的Tyr殘基-OH基共價(jià)連接，3’-OH端與酶的另一臂共價(jià)連接；一條臂跨過未被切斷的單鏈后，將5’-P與3’-OH重新連接，使DNA雙螺旋減少一圈。E.coli的TopoI（ω蛋白）的作用過程351）特點(diǎn)同時(shí)切割超螺旋DNA的雙鏈，并重新連接，一次反應(yīng)能改變兩個(gè)連環(huán)數(shù)；需要輔助因子ATP能量，能除去正超螺旋等需能量的反應(yīng)；主要在DNA復(fù)制中起作用。2）TopoII可分為兩個(gè)亞類一亞類能引入負(fù)超螺旋，如E.coli旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）另一亞類是使超螺旋DNA（無論正負(fù)）變?yōu)闆]有超螺旋的松弛DNA。2、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II（TopoisomeraseII）36TopoⅡ:對(duì)雙鏈DNA同時(shí)切斷，另一段DNA通過切口，然后斷端按原位連接而改變DNA的拓?fù)鋺B(tài)，一般反應(yīng)可改變連環(huán)數(shù)2。37E.coli旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）結(jié)構(gòu)特征由兩個(gè)A亞基和兩個(gè)B亞基構(gòu)成的四聚體；A亞基具有切割雙鏈DNA，進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)改變和重新連接的功能；B亞基具有ATPase酶活性。38（三）單鏈結(jié)合蛋白（SSB）1、SSB是缺乏酶活性的復(fù)制輔助蛋白，是復(fù)制體其它酶有效活性所必需的。SSB對(duì)單鏈DNA有高親和性，對(duì)雙鏈沒有親和力。2、功能穩(wěn)定DNA單鏈區(qū)域：穩(wěn)定熔解起點(diǎn)、維持螺旋酶活性、從DNA模板上去除二級(jí)結(jié)構(gòu)、抑制核酸酶活性；與復(fù)制體不同組分相互作用以促進(jìn)這些組分的活性，例如與引發(fā)酶或引發(fā)體的組分相互作用促進(jìn)其特定的引發(fā)活性。3940（一）DNA聚合酶

1、DNA聚合酶

以DNA為模板合成DNA新鏈時(shí)需要的酶，DNA聚合酶從5‘到3’把核苷酸連續(xù)加在延伸DNA的游離3‘羥基上。2、DNA聚合酶的特性

1）底物必須是dNTP；

2）以DNA為模板，鏈延伸功能，不能從頭開始合成；

3）合成方向只能是5‘→3’。二、復(fù)制延伸和終止有關(guān)的酶和蛋白413、DNA聚合酶的種類——大腸桿菌42大腸桿菌有多種DNA聚合酶，其中只有聚合酶III是DNA復(fù)制必需，作用是隨復(fù)制叉移動(dòng)延長(zhǎng)新生鏈；聚合酶I主要是添補(bǔ)后滯鏈的間隙及負(fù)責(zé)損傷DNA的修復(fù)等功能；DNA聚合酶I具有5’→3’方向核酸外切酶活性，能切除引物RNA。43

DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III結(jié)構(gòu)分子量（道爾頓）構(gòu)成（亞基數(shù)）數(shù)量/細(xì)胞103,000140088,0004不清楚>900,00010異多聚體10-20酶活性5’-3’聚合酶活性3’-5’外切酶活性5’-3’外切酶活性

++++

++

（可切單鏈）突變突變位點(diǎn)突變表現(xiàn)型polA修復(fù)缺陷polB修復(fù)缺陷polC,dnaN,dna,dnaQ,dnaT復(fù)制受阻大腸桿菌的三種主要DNA聚合酶

444、DNA聚合酶的種類——真核生物真核生物中發(fā)現(xiàn)5種DNA聚合酶，、、和定位于核內(nèi)，而位于線粒體；

在DNA合成期水平升高，主要負(fù)責(zé)復(fù)制引發(fā)和后滯鏈部分序列的合成；

是DNA雙鏈合成的主要聚合酶，在合成起始后存在聚合酶/的轉(zhuǎn)換（switch）；DNA聚合酶

沒有3’→5’核酸外切酶活性；而和有校正閱讀活性，保證復(fù)制忠實(shí)性。45哺乳動(dòng)物的DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

DNA聚合酶

位置功能細(xì)胞核引發(fā)和起始復(fù)制細(xì)胞核鏈延伸線粒體線粒體復(fù)制細(xì)胞核后隨鏈完成修復(fù)分子量(D)亞基數(shù)目300,0004170-230,0001180-300,000140,0001雙脫氧甲基嘧啶蚜棲菌素?zé)o影響抑制弱強(qiáng)抑制無影響抑制無影響465、DNA聚合酶的功能1）DNA合成所必需

DNA合成活性是所有DNA聚合酶的基本功能，在其催化下作為合成前體的dNTP可依照模板連接到新生鏈的3‘-OH端。

47DNA合成的兩種基本類型：DNA復(fù)制和修復(fù)。Semi-conservativereplicationsynthesizestwonewstrandsofDNA.

RepairsynthesisreplacesadamagedstrandofDNA.

482）多方面的核酸酶活性DNA聚合酶I是一“多能”酶，由polA編碼，可水解成兩部分：較大的部分（68KD）叫Klenow片段，具聚合活性和3‘→5’外切核酸酶活性；小片段（34KD）具5‘→3’外切核酸酶活性，外切活性可切除達(dá)10個(gè)核苷酸的小片段，利用這一功能可實(shí)現(xiàn)缺口平移（nicktranslation）。

利用DNA聚合酶I可進(jìn)行體外的DNA放射性標(biāo)記。

聚合酶III是一大的酶復(fù)合體，含多個(gè)亞基，每個(gè)亞基有不同酶活。亞基具有合成活性；而亞基具有3‘→5’核酸外切校正活性，保證復(fù)制的準(zhǔn)確性。49503’-5’外切功能5’-3’外切功能Klenow片段的晶體結(jié)構(gòu)51缺口翻譯（nicktranslation）大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ可利用雙螺旋DNA鏈上由一個(gè)磷酸二酯鍵斷裂產(chǎn)生的缺刻(nick)，將一條單鏈降解并從缺刻的3’-OH端合成一條新鏈替代降解的同源鏈，這一過程稱缺口平移。523）保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性校正(proofreading)

糾正蛋白質(zhì)或核酸合成發(fā)生錯(cuò)誤的機(jī)制，包括對(duì)已加入到合成鏈上的單位進(jìn)行核查，對(duì)錯(cuò)配堿基依靠聚合酶3’→5’核酸外切活性來校正。例如，復(fù)制中每添加一堿基發(fā)生錯(cuò)配的幾率約10

3，而實(shí)際錯(cuò)配率約10

8-10

10。DNA聚合酶在兩個(gè)階段控制堿基配對(duì)的特異性：

合成前錯(cuò)誤控制：通過對(duì)不同堿基特性的特異性識(shí)別、核對(duì)所引入的堿基是否與模板堿基配對(duì)；

合成后校正：檢查生長(zhǎng)鏈末端堿基配對(duì)情況，通過外切功能除去錯(cuò)配堿基。53細(xì)菌DNA聚合酶的校正功能

Inthechainelongationstep,aprecursornucleotideentersthepositionattheendofthegrowingchain.Abondisformed.Theenzymemovesonebasepairfurther,readyforthenextprecursornucleotidetoenter.Ifamistakehasbeenmade,theenzymemovesbackward,excisingthelastbasethatwasadded,andcreatingasiteforareplacementprecursornucleotidetoenter.

546、DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合于三個(gè)結(jié)構(gòu)域所組成的大溝上?！笆终啤苯Y(jié)構(gòu)域：具有高度保守的模體，提供催化活性位點(diǎn)?！笆种浮苯Y(jié)構(gòu)域：將模板正確結(jié)合到活性位點(diǎn)?！澳粗浮苯Y(jié)構(gòu)域：行使前進(jìn)能力。N結(jié)構(gòu)域：核酸酶活性。557、DNA聚合酶III全酶裝配模型

、

、亞基組成核心酶，是催化核心;

亞基是進(jìn)行性因子，以二聚體形式形成一個(gè)可以沿DNA滑動(dòng)的“滑動(dòng)夾”，使核心酶附著于模板;

復(fù)合物控制了酶的進(jìn)行性，即亞基在DNA上的定位和解離都需要復(fù)合物，

亞基只與一個(gè)單體結(jié)合.

亞基連接核心酶形成二聚化;56（二）DNA連接酶專門催化“切刻”——即二酯鍵的5‘-磷酸基與3’-羥基的連接，要求各自的堿基處于配對(duì)狀態(tài)。連接所需的能量來自NAD+（細(xì)菌）或ATP（真核細(xì)胞、古細(xì)菌）。連接酶在DNA復(fù)制、重組、修復(fù)中均有重要作用。

57（三）DNA引發(fā)酶在DNA合成過程中合成RNA引物。功能：

1）在起點(diǎn)處起始先導(dǎo)鏈的合成(1次)；

2）協(xié)助岡崎片段的反復(fù)起始。引發(fā)體(primesome)：由引發(fā)酶和解旋酶形成的功能復(fù)合物。引發(fā)酶的有效引發(fā)活性依賴于解旋酶。不同的復(fù)制子對(duì)引發(fā)要求不同，有的復(fù)制起點(diǎn)可被引發(fā)酶直接識(shí)別，沒有引發(fā)體，如噬菌體G4；而型復(fù)制子的引發(fā)體含有多個(gè)蛋白，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。58復(fù)制體各組分的功能復(fù)制體成分在復(fù)制中的功能DNA聚合酶DNA連接酶單鏈結(jié)合蛋白DNA解旋酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶引發(fā)酶RNaseH多種形式，分別負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈的合成，后滯鏈的合成及后滯鏈的修復(fù)連接修復(fù)的后滯鏈片段穩(wěn)定復(fù)制叉的單鏈區(qū)域使復(fù)制叉前面的DNA解鏈釋放因解旋酶的活性而造成的扭曲鏈，復(fù)制后使松弛的DNA雙鏈恢復(fù)負(fù)超螺旋；RNA引物的合成切除RNA引物59細(xì)菌和真核生物復(fù)制體性質(zhì)比較復(fù)制體性質(zhì)細(xì)菌真核生物復(fù)制起點(diǎn)延伸速度岡崎片段長(zhǎng)度引發(fā)策略復(fù)制聚合酶拓?fù)鋵W(xué)單個(gè)100kbpmin-11-2kbp引發(fā)酶產(chǎn)生引物，由polIII延伸不同進(jìn)行性單體的異源二聚體松弛和卷曲間存在平衡，負(fù)超螺旋很多2kbpmin-1100-200bp由pol

引發(fā)并起始合成，由pol

延伸完成每條鏈有不同的酶，有不同的進(jìn)行性濃縮在核小體中的負(fù)超螺旋6061一、DNA復(fù)制的起始與引發(fā)

（一）引發(fā)的一般原則與策略1、DNA單鏈狀態(tài)是復(fù)制所必需的；2、DNA復(fù)制的起始需要引發(fā)。一般情況下，

DNA引發(fā)酶合成RNA引物用于DNA復(fù)制引發(fā)；3、原核生物中，引物直接由DNA聚合酶III延伸；4、真核生物中，DNA聚合酶在每個(gè)引物上加上4-5個(gè)脫氧核苷酸[起始DNA(initiatorDNA)]，DNA末端由DNA聚合酶δ延伸。5、先導(dǎo)鏈的引發(fā)有一系列不同的策略；而由DNA引發(fā)酶合成的短RNA引物是后滯鏈合成的通用引發(fā)方式。第三節(jié)原核生物的復(fù)制機(jī)理62先導(dǎo)鏈引發(fā)的不同機(jī)制引發(fā)機(jī)制細(xì)節(jié)舉例RNA引物發(fā)夾引發(fā)內(nèi)切引發(fā)入侵引發(fā)末端蛋白引發(fā)寡核苷酸引發(fā)DNA引發(fā)酶合成短新生寡聚核苷酸RNA聚合酶合成特殊轉(zhuǎn)錄本預(yù)先形成的tRNA引物的退火單鏈DNA反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列形成發(fā)夾內(nèi)切酶在雙鏈DNA產(chǎn)生切口暴露3‘-OH3‘末端通過同源重組導(dǎo)入部分線形DNA由末端核酸結(jié)合蛋白引發(fā)體外延伸時(shí)寡核苷酸退火到模板上細(xì)胞DNA線粒體,ColE、逆轉(zhuǎn)錄病毒皰疹病毒滾環(huán)復(fù)制T4晚期復(fù)制腺病毒PCR,cDNA合成63引物1、參與引物合成的酶引發(fā)酶：細(xì)菌、部分噬菌體DNA聚合酶：真核生物、部分噬菌體；RNA聚合酶：M13噬菌體；2、引物的長(zhǎng)度

X174和E.coli前導(dǎo)鏈：2-5個(gè)堿基；真核生物和岡崎片斷：10個(gè)堿基；M13和G4：20-30個(gè)堿基。64引發(fā)的不同形式65（二）噬菌體DNA復(fù)制的引發(fā)1、單鏈?zhǔn)删wDNA復(fù)制的不同引發(fā)方式G4噬菌體不用RNA聚合酶，而由dnaG編碼的蛋白負(fù)責(zé)引發(fā)，即引發(fā)酶；M13噬菌體以RNA聚合酶來合成引物；

X174復(fù)制RNA引物的合成需更多蛋白因子，這一蛋白復(fù)合物稱引發(fā)體（primosomecomplex)；

X174是多位點(diǎn)引發(fā)，而另兩種噬菌體是單一位點(diǎn)。2、引發(fā)酶

引發(fā)酶是一種特殊的RNA聚合酶，由dnaG編碼，比一般的E.coliRNA聚合酶小，分子量為65kD。66單鏈?zhǔn)删wDNA復(fù)制中RNA引發(fā)的三種機(jī)制673、噬菌體的復(fù)制起始復(fù)制原點(diǎn)大約是350bps，包括：4個(gè)高度保守的19bp組成的正向ori重復(fù)序列，40bp組成的富含A/T序列，28bp的回文序列；PROR發(fā)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄是

DNA復(fù)制必需的，一方面使復(fù)制原點(diǎn)解鏈，另一方面轉(zhuǎn)錄了基因O和基因P；O蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是四個(gè)ori重復(fù)序列，隨著O蛋白聚集體的形成，P蛋白和DnaB解旋酶以P-DnaB復(fù)合的形成加入，形成oriλ-O-P-DnaB復(fù)合物。P蛋白能抑制DnaB螺旋酶的ATP酶活性，因此P蛋白失活或者從復(fù)合物中脫落的情況下，DNA復(fù)制才能起始。68E.coli

復(fù)制起始有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)（三）大腸桿菌雙鏈復(fù)制的起始69E.Coli復(fù)制起始大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)oriC最小序列245bp，含有4個(gè)9bp和3個(gè)13bp的特征DNA序列；9bp是DnaA結(jié)合位點(diǎn)，20-40個(gè)DnaA單體順序結(jié)合oriC形成中央核心；3個(gè)13bp重復(fù)區(qū)段是AT豐富區(qū)，在DnaA蛋白作用下熔解；70形成起始復(fù)合物

DnaA與復(fù)制原點(diǎn)的4個(gè)9聚體DNA序列結(jié)合，不需要ATP。形成開放復(fù)合物

20-40個(gè)DnaA聚集于此，形成開放復(fù)合物，DNA在13聚體處熔解，需要ATP和控制DNA結(jié)構(gòu)的HU蛋白。形成預(yù)引發(fā)體

DnaB解旋酶在DnaC的幫助下定位，DnaC從復(fù)合物中釋放。形成引發(fā)體

DNA被DnaB解鏈，形成雙向復(fù)制叉，引發(fā)酶加入，合成引物。DNA合成延伸

征集拓?fù)洚悩?gòu)酶和SSB，在polIII作用下延伸開始。71電鏡下復(fù)制起點(diǎn)結(jié)構(gòu)

OriC形成的復(fù)合物。上面顯示了復(fù)制前的預(yù)引發(fā)體復(fù)合物，下面顯示起始復(fù)制1分鐘后復(fù)制泡的復(fù)合物，兩種復(fù)合物均可通過DnaB抗體作用觀察到。

72（四）后滯鏈起始機(jī)制

復(fù)制叉前進(jìn)后，在引發(fā)體后面產(chǎn)生單鏈區(qū)，單鏈區(qū)隨之被SSB覆蓋，后滯鏈處于適于做模板狀態(tài)，引發(fā)體產(chǎn)生后滯鏈岡崎片段的RNA引物，因此引發(fā)體移動(dòng)方向與復(fù)制叉一致但與岡崎片段延伸方向相反。

73二、復(fù)制延伸過程1.DNA復(fù)制延伸的5個(gè)階段雙鏈DNA不斷解螺旋；前導(dǎo)鏈DNA的合成；后滯鏈不斷合成新的RNA引物；合成岡崎片段；RNA引物去除，岡崎片段連接。74752、雙鏈復(fù)制回環(huán)模型1）不對(duì)稱的復(fù)制體（replisome）DNA聚合酶III是不對(duì)稱二聚體，有兩個(gè)DNA合成的催化中心；在復(fù)制叉處，DNA聚合酶III和引發(fā)體以及其他復(fù)制蛋白構(gòu)成復(fù)制復(fù)合體；每個(gè)復(fù)制中心含有兩個(gè)亞基；亞基負(fù)責(zé)將DNA聚合酶III結(jié)合為二聚體。全酶是不對(duì)稱的，只有一個(gè)

復(fù)合物。76DNA復(fù)制延伸時(shí)，前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成各利用DNA聚合酶III的一個(gè)催化中心；后滯鏈的模板圍繞其中一個(gè)催化中心折疊成環(huán)狀，使后滯鏈方向顛倒，但生化反應(yīng)方向不變，使前導(dǎo)鏈和后滯鏈同時(shí)合成。2）雙鏈復(fù)制回環(huán)77環(huán)上RNA引發(fā)酶形成引物，DNA聚合酶隨后延伸，DNA聚合酶沿復(fù)制叉移動(dòng)，復(fù)制片段延長(zhǎng)，環(huán)變大，直至遇到下一個(gè)岡崎片段，釋放環(huán)。模型的關(guān)鍵在于前導(dǎo)鏈與后滯鏈合成的進(jìn)行性及DNA聚合酶的不對(duì)稱性。78先導(dǎo)鏈與后滯鏈同時(shí)復(fù)制模型79三、復(fù)制的終止1.大腸桿菌的復(fù)制有固定的終點(diǎn)終止子(terminator)：染色體和質(zhì)粒DNA中復(fù)制終止的特定序列；2個(gè)終止區(qū)域：每個(gè)區(qū)域含有若干個(gè)終止子(terE,D,A和terC,B)，每個(gè)終止區(qū)可終止一個(gè)方向復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)。2.多數(shù)環(huán)狀DNA復(fù)制沒有固定終點(diǎn)，僅是兩個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)的簡(jiǎn)單碰撞。3.環(huán)狀分子復(fù)制后產(chǎn)生連環(huán)分子(catenane)，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的催化下將連環(huán)分子分離。（一）環(huán)狀DNA復(fù)制的終止80大腸桿菌復(fù)制的終止終止子帶有約23bp的短一致序列（consensussequence）tus基因編碼蛋白Tus可識(shí)別該序列并與之結(jié)合抑制復(fù)制叉的前進(jìn)，ter-Tus阻斷復(fù)制的功能有方向依賴性；ter-Tus復(fù)合物可能通過抑制解旋酶來實(shí)行復(fù)制終止。8182（二）線狀DNA復(fù)制的完成

1、線形DNA復(fù)制存在的問題——5’末端“隱縮”832、對(duì)策線狀DNA環(huán)化（

噬菌體）或連成多聚體（T7噬菌體）；DNA形成特殊結(jié)構(gòu)，如末端產(chǎn)生發(fā)夾，不產(chǎn)生自由末端；還可以形成十字交叉結(jié)構(gòu)，如草履蟲線狀線粒體DNA復(fù)制；專一性蛋白與末端作用保證其引發(fā)，腺病毒、φX29噬菌體等線性病毒核酸有蛋白與5’末端堿基共價(jià)相連?？勺兡┒?，真核生物DNA末端有多拷貝的短重復(fù)單位，拷貝數(shù)可變化，可以加上或去掉。841）T7噬菌體線性DNA末端復(fù)制末端冗余：T7噬菌體分子兩端有重復(fù)的序列；后滯鏈最后一個(gè)岡崎片段的RNA引物水解后，在子代5’端各缺少一段核苷酸——“隱縮”現(xiàn)象；復(fù)制后兩個(gè)子代分子單鏈末端互補(bǔ)、退火形成二聚體；內(nèi)切核酸酶作用，產(chǎn)生供延伸的3’-OH端和5’突出末端。在聚合酶作用下形成正常的兩個(gè)子代分子。852）腺病毒DNA的復(fù)制復(fù)制起始86腺病毒DNA復(fù)制過程腺病毒兩端有反向末端重復(fù)序列；腺病毒兩端各有一復(fù)制原點(diǎn)；起始復(fù)合物：當(dāng)腺病毒單鏈DNA結(jié)合蛋白和ATP存在時(shí)，末端蛋白TP催化末端解鏈；在腺病毒DNA聚合酶催化下dCTP與pTP以磷酸二酯鍵共價(jià)相連；C與模板3‘端的G以氫鍵相配對(duì)；通過鏈置換首先完成一條鏈的合成；被置換出的鏈形成“平底鍋”結(jié)構(gòu)，再以同樣的方式復(fù)制其互補(bǔ)鏈。87第四節(jié)病毒基因組復(fù)制的多樣性一、單鏈RNA病毒的復(fù)制1、類型：?jiǎn)捂溦齊NA，即()RNA病毒單鏈負(fù)RNA，即()RNA病毒2、單鏈RNA病毒的復(fù)制酶

依賴于RNA的RNA聚合酶依賴于RNA的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶883、單鏈RNA病毒的復(fù)制方式1）依賴于RNA的RNA聚合酶作用的復(fù)制892）依賴于RNA的DNA聚合酶作用的復(fù)制1970年Temin和Migufan等發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄酶具有RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，同時(shí)具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性，其引物是tRNA；作用過程：1）逆轉(zhuǎn)錄酶以病毒單鏈RNA為模板，在引物3’-OH端合成互補(bǔ)的DNA鏈，形成DNA-RNA雜交分子；2）RNaseH降解雜和分子中的RNA，剩下一條DNA鏈；3）在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，從DNA回折的3’-OH端延伸出互補(bǔ)的DNA鏈，而形成雙鏈DNA，稱cDNA。4）再從cDNA合成子代病毒RNA。逆轉(zhuǎn)錄病毒形成的雙鏈cDNA常可整合入宿主，引發(fā)癌變，所以逆轉(zhuǎn)錄病毒常常有致癌作用。

逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）9091HIV復(fù)制HIV進(jìn)入細(xì)胞，以tRNA為引物，逆轉(zhuǎn)錄酶合成5’端PB/U5/R區(qū)域DNA；RNaseH切除DNA/RNA雙鏈中的模板RNA；模板轉(zhuǎn)換，新生成的DNA與HIV基因組3’端配對(duì)，在RT的作用下合成(

)DNA；RNaseH水解除env區(qū)外的大部分(

)RNA，剩余的env區(qū)小段RNA作為引物合成(

)DNA；5’端tRNA和部分(

)RNA移去，第二次跳躍，RT進(jìn)行DNA復(fù)制，產(chǎn)生雙鏈DNA；雙鏈DNA末端形成U3-R-U5的長(zhǎng)LTR結(jié)構(gòu)。92二、雙鏈RNA病毒的復(fù)制1、基因組特點(diǎn)：雙鏈RNA病毒基因組是不連續(xù)，不同的雙鏈RNA是分開的。呼腸弧病毒有10個(gè)片段，輪狀病毒有11個(gè)片段。2、轉(zhuǎn)錄：雙鏈RNA病毒的負(fù)鏈RNA合成mRNA，然后翻譯成各種蛋白質(zhì)；3、復(fù)制：以基因組負(fù)鏈RNA為模板合成許多正鏈RNA，再在RNA聚合酶的作用下合成雙鏈RNA。93三、雙鏈DNA病毒的復(fù)制941、病毒類型：1）從攜帶信息來區(qū)分：基因組為()DNA和基因組為()DNA；2）從形狀來區(qū)分：環(huán)狀和線性，環(huán)狀如M13、G4、

174

；四、單鏈DNA病毒的復(fù)制952、單鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制第一階段以親本鏈（＋鏈）為模板合成互補(bǔ)的環(huán)狀負(fù)鏈，形成閉合環(huán)狀的復(fù)制形（RF1）。第二階段以滾環(huán)復(fù)制（loopedrollingcirclereplication）產(chǎn)生多個(gè)子代RF；第三階段以RF的負(fù)鏈為模板進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生多拷貝正鏈單環(huán)。96１）174的復(fù)制過程Φ

174RNA引物的合成需多個(gè)蛋白因子，這一蛋白復(fù)合物稱引發(fā)體(primosome)；Φ

174有一個(gè)預(yù)引發(fā)位點(diǎn)，而引發(fā)位點(diǎn)有許多個(gè)；引發(fā)體在單鏈DNA上是沿著模板5‘-3’方向移動(dòng)，同DNA合成方向相反；當(dāng)引發(fā)體發(fā)現(xiàn)引發(fā)位點(diǎn)時(shí)就可以合成引物RNA，因此所復(fù)制的負(fù)鏈?zhǔn)怯梢幌盗袑槠谓M成，因此新生的DNA鏈?zhǔn)呛鬁?。?fù)鏈合成97RF-I復(fù)制型通過滾環(huán)復(fù)制合成正鏈多拷貝A蛋白結(jié)合其識(shí)別位點(diǎn)并誘導(dǎo)富含A/T序列熔解；A蛋白在一特定位點(diǎn)切斷磷酸二酯鍵，并與端裂的5‘核苷酸共價(jià)連接；在Rep、SSB和polIII協(xié)同作用下，(+)鏈的3’-OH不斷延伸，5’端不斷被置換；復(fù)制到起始原點(diǎn)序列時(shí)，A蛋白在此處將鏈切斷，并環(huán)化。982）M13噬菌體基因組除59bp序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)外，其余均被SSB覆蓋，發(fā)夾結(jié)構(gòu)是起始信號(hào)；寄主RNA聚合酶在此結(jié)構(gòu)前起始RNA引物合成（20-30堿基），發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開；SSB結(jié)合到發(fā)夾結(jié)構(gòu)中未形成雜交鏈的部分，終止發(fā)夾頂端的轉(zhuǎn)錄；RNA引物被DNA多聚酶Ⅲ延伸，至RNA引物的另一端；DNA聚合酶Ⅰ的外切活性切除RNA，并填補(bǔ)空隙；缺刻最終由連接酶接上。993、單鏈線性DNA的復(fù)制——細(xì)小病毒細(xì)小病毒反義DNA鏈的合成需借助于宿主細(xì)胞的RNA聚合酶和DNA聚合酶；細(xì)小病毒(+)DNA基因組兩端有可通過折疊互補(bǔ)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列；3’端發(fā)夾可作為DNA復(fù)制的引物，合成互補(bǔ)鏈，經(jīng)連接酶連接后形成環(huán)狀DNA；發(fā)夾結(jié)構(gòu)被特異性限制性內(nèi)切酶切割后，得到線性雙鏈DNA；雙鏈階段，反義鏈既可作為轉(zhuǎn)錄的末板，也可作為復(fù)制有義鏈的模板。100第五節(jié)真核生物的DNA復(fù)制

1、DNA甲基化：胞嘧啶C5位甲基化促使染色體結(jié)構(gòu)解開，有利于復(fù)制酶和蛋白因子的結(jié)合；2、有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)不是同時(shí)開啟；復(fù)制起點(diǎn)也是變化的，發(fā)育活化的細(xì)胞有更多的復(fù)制起點(diǎn)；3、真核生物染色體在全部復(fù)制完成前，各復(fù)制起點(diǎn)不能進(jìn)行新一輪復(fù)制；4、引發(fā)酶是DNA聚合酶的一個(gè)亞基；復(fù)制延伸階段發(fā)生DNA聚合酶/轉(zhuǎn)換。（一）真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)101102（二）真核生物DNA復(fù)制酶和蛋白因子βγ1031、真核生物的DNA聚合酶和引發(fā)酶5’-3’104DNA聚合酶/引發(fā)酶負(fù)責(zé)兩條鏈復(fù)制的引發(fā)；既具有聚合酶活性，也具引發(fā)酶活性，二者是偶連的；具有5’→3’聚合活性，無3’→5’外切酶活性，其功能RNA引物和起始DNA（iDNA）合成。105起始DNA（initiatorDNA,iDNA）