第4章 基因工程載體(植物基因工程)

第五章基因工程載體第一節(jié)克隆載體第二節(jié)表達載體第三節(jié)其它特殊用途載體第四節(jié)宿主系統(tǒng)本章重點掌握的內容掌握載體、克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、α-互補、插入失活、人工染色體載體的概念?？寺≥d體DNA分子具備的條件。標記基因的分類及其作用。質?？寺≥d體用途。λ-DNA載體的構建、類型及其優(yōu)點。植物表達載體的組成、啟動子的類型等

遺傳物質+載體

重組的DNA分子引入細胞或生物體內復制與表達穩(wěn)定地遺傳給下代為什么要用到載體？基因工程流程圖為什么需要載體？

1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個元件，一般是不可以進入受體細胞的；

2）采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內維持。載體的概念載體（vector)基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。目的基因能否有效轉入受體細胞，并在其中維持高效表達，在很大程度上決定于載體。載體的功能載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因的擴增或表達提供必要的條件為外源基因提供整合能力

載體的要求A、復制起點：能在受體中復制；B、選擇標記和篩選標記；C、限制性內切酶切割位點（多克隆位點）；D、載體的大小：原則上要求載體越小越好；E、適當?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質粒不能隨便轉移;G、外源基因的表達：啟動子。大腸桿菌質粒載體pBR322結構圖

復制起點

選擇標記基因克隆位點克隆位點載體的分類按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達載體用于一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類

質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體載體的種類和特征質粒受體細胞結構插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,pBR322等

λ噬菌體載體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒載體E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)載體E.coli環(huán)狀≈300kbpBeloBAC11YAC(YeastArtificialchromosome)載體酵母細胞線性染色體100-2000kbpYAC4MAC(MammalianArtificialChromosome)載體哺乳類細胞線性染色體＞

1000kbpCXLamIntWT,pCXLamIntRandpCXLamIntROK病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒第一節(jié)

克隆載體一、質粒載體1.質粒的概念質粒（plasmid)是一種存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，可自主復制和表達。

并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

分子量在1-200kb之間。一、質粒載體大腸桿菌的質粒一、

質粒載體2.質粒的空間構型①共價閉合環(huán)狀DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）

一、

質粒載體②

開環(huán)DNA（

opencircular，

ocDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。

③

線形DNA（

linear，LDNA）一、

質粒載體同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：

SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。

SC

OC

L

一、

質粒載體3.質粒的基本特性

質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制。質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質粒（stringentplasmid）

(拷貝數(shù)少，為1-5個)和松弛型復制控制的質粒（relaxed）

(拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝)因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。質粒

復制子

拷貝數(shù)

pBR322及其衍生質粒

pMB115～20pUC系列質粒及其衍生質粒

突變的

pMB1500～700pSC101及其衍生質粒pSC101～5ColE1ColE115～20一、質粒載體質粒的不相容性(incompatibility,又稱質粒的不親和性)

兩種質粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質粒的不相容性。具有不相容性的質粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復制子。

以大腸桿菌的質粒為例：

ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容

pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容

p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容

一、

質粒載體質粒的可轉移性

接合型質粒

能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉移到另一個細胞（接合作用）。

非接合型質粒

不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。

值得注意的是，某些非接合型質粒在接合型質粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉移，這個過程由

mob、tra基因、順式作用原件bom及其內部的轉移缺口位點nic決定。一、

質粒載體TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質粒的oriT位點，借助接合質粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質粒被動遷移到受體細胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。質粒的可轉移性一、質粒載體大腸桿菌接合（conjunction）質粒DNA的tra基因

E.Coli產(chǎn)生菌毛宿主與受體細胞結合遺傳物在細胞之間轉移（指令）（遷移）一、質粒載體攜帶特殊的遺傳標記

野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：

物質抗性

抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物

物質合成

抗生素、細菌毒素、有機堿

這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義一、

質粒載體遺傳標記基因

定義:在基因工程中用來篩選導入了重組DNA的細胞的基因。選擇標記基因、篩選標記基因標記基因的作用

1.指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞

2.指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子

一、

質粒載體遺傳標記基因的種類

1.抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2.營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，

這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3.生化標記基因

其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ（β-半乳糖苷酶），GUS（葡萄糖苷酸酶），CAT（過氧化氫酶）

一、

質粒載體一、

質粒載體抗藥性標記選擇(插入失活法)

一、

質粒載體常用的篩選標記基因

β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。

β-半乳糖苷酶基因的優(yōu)點:a.

催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀

b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達可使載體小而容量大

一、

質粒載體α互補（藍白班篩選）野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質5-溴-4-靛藍。β-半乳糖苷酶缺陷型菌株中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍色物質。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子；編碼α肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(MCS)。當菌體中含有帶lacz'的質粒后，質粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質的能力，這種現(xiàn)象即α-互補。操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍色。當外源DNA（即目的片斷）與含lacz'的載體連接時，會插入進MCS，使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質粒不再表達α肽鏈，將它導入宿主缺陷菌株則無α互補作用，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。一、

質粒載體

PLacZαLacZβ

轉錄

翻譯

α

β

LacZ基因的結構與產(chǎn)物一、

質粒載體lacZ

β-半乳糖苷酶分解乳糖i

P

O

調控蛋白P

大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)一、

質粒載體lacZ-β-半乳糖苷酶-分解乳糖i

P

O

調控蛋白P

α-肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍色誘導劑IPTGa-互補顯色反應（藍白斑篩選）β-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15？一、

質粒載體X-galX-gal

-peptideC-terminusofb-galactosiase

一、

質粒載體互補顯色反應

一、

質粒載體α-互補(α-complementation)

一、

質粒載體常用的篩選標記基因

葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。

熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

發(fā)光蛋白質基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質，該蛋白質可使大腸桿菌菌落呈藍色。

一、

質粒載體4.質粒的命名原則人工組建的質粒

人工組建的質粒的第一個字母是質粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質粒的作者和實驗室名稱，再其后為質粒的編號。如pBR322，字母p代表質粒，BR是構建該質粒的研究人員的姓名，322代表…構建的一系質粒的編號。一、

質粒載體

5.質粒載體的發(fā)展概況

第一階段（1977年前）天然質粒和重組質粒的利用，如pSC101,ColE1,pCR,pBR313和pBR322。

第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標記基因。如pUC系列載體。

第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。一、

質粒載體6.質粒載體構建

天然存在的野生型質粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質粒為基礎進行人工構建。目前實驗室使用的大腸桿菌質粒大多是由少數(shù)幾個野生型質粒構建的：

pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標記基因Tcr

ColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內毒素標記基因E1

RSF2124ColE1衍生質粒氨芐青霉素抗性標記基因Ampr一、

質粒載體

第一個用于基因克隆的天然質粒,克隆位點少，Tetr

作為篩選標志。A、刪除不必要的DNA區(qū)域:

盡量縮小質粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。B、減少限制性酶切點:

缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶的共同作用，質粒之間的重組等方法。C、加入易于識別的選擇標記：通過質粒之間的重組，可以使質粒帶有合適的選擇性標記。D、安全性能改造：質粒載體不能在細菌之間隨便轉移。E、改造或加入基因表達的調控序列：啟動子。質粒的改造pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI一、

質粒載體一、

質粒載體7.質粒載體的分類

人工構建的質粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：

高拷貝質粒

突變拷貝數(shù)控制基因

拷貝數(shù)1000-3000

擴增基因

低拷貝質粒

來自pSC101拷貝數(shù)小于10表達某些毒性基因

溫敏質粒

在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質

測序質粒

含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker

整合質粒

裝有整合促進基因及位點

便于外源基因的整合

穿梭質粒

裝有針對兩種不同受體的復制子

便于基因克隆

表達質粒

裝有強化外源基因表達的轉錄、翻譯、純化的元件

探針質粒

裝有報告基因

便于啟動子等元件的克隆篩選一、

質粒載體8.常用質粒載體（1）pBR322復制起點

ori：pMB1系列（來源于ColE1）高拷貝型復制起點Ampr基因：pSP2124質粒的Ampr基因Tetr基因：pSC101的Tetr

基因。長度：4363bp選擇標記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。克隆位點：含有多個克隆位點。

Ampr基因內可被PstI，PvuI，SacI切開，而Tetr基因可被BamHI，HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。一、

質粒載體pBR322質粒載體優(yōu)點：

第一，具有較小的分子量——4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。一、

質粒載體一、

質粒載體（2）pUC系列質粒載體在pBR322的基礎上改造而成。其組成如下：含有pBR322完整的Ampr基因和復制起始點。含有大腸桿菌

-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼

-肽鏈的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。

pUC18、pUC19生命科學學院一、

質粒載體一、

質粒載體

pUC質粒載體的優(yōu)點：具有較小的相對分子質量和更高的拷貝數(shù)，平均每個細胞可達500-700個拷貝。適用于組織化學方法檢測重組體，有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的

-肽鏈可參與

-互補作用，在IPTG誘導和底物X-gal存在下，形成藍色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。一、

質粒載體（3）穿梭質粒載體(shuttlevector)：這種質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制子結構以及相應的選擇性標記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質粒等。一、質粒載體TA克隆載體(補充)

用Taq酶的PCR產(chǎn)物3’端加上了一個A。根據(jù)這一特點研制出一種線性質粒，其5’端突出的T，它們之間可以連接，即TA克隆。

再生TA克隆載體的方法：①克隆載體的線性化②克隆載體末端補平③克隆載體末端加T一、

質粒載體二、噬菌體載體

噬菌體（Bacteriophage）即細菌病毒，是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。其核心是一段DNA(線性)，外圍有一個蛋白質外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內。二、噬菌體載體

噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：

1.高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞；

2.自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學特性

λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體；λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成；λDNA在噬菌體中是雙鏈線狀DNA分子，全長

48.5kb，有60多個基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)

。

cos位點（cohesiveendsite):在DNA兩端各有12nt的5`單鏈突出(5‘-GGGCGGCGACCT-3’)，彼此序列互補。它是包裝時的切割信號。二、噬菌體載體λ噬菌體的生活周期二、噬菌體載體粘性末端：12bp的互補單鏈

當λ噬菌體進入寄主細胞內后,其粘性末端能通過堿基互補作用,形成環(huán)狀DNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點,它是包裝蛋白的識別位點。λ噬菌體的包裝與DNA特性和其它序列無關,但對包裝的DNA大小有要求,包裝范圍大約在36kb-51kb。

二、噬菌體載體λ噬菌體作為構建載體材料的依據(jù)：λ噬菌體是一種溫和噬菌體；能承載比較大的外源DNA片段；在λ噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點，便于多種DNA酶切片段的克隆。二、噬菌體載體(二)構建λ噬菌體的基本原理

(1)λ噬菌體的缺陷：

基因組太大（48.5kb）；

酶切點太多，它有5個BamH1位點（G↓GATCC），6個BgⅠ位點（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點（G↓AATTC）。

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納48.5kb×5%=2.425kb的DNA。

重組的λDNA分子難于直接導入宿主細胞，需在體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。二、噬菌體載體(三)構建λ噬菌體的基本內容

構建λ噬菌體克隆載體的基本策略：

切去部分非必須的區(qū)域；抹去多余的限制性內切酶切割位點；插入可供選擇的標記基因；建立體外包裝系統(tǒng)。二、噬菌體載體選擇標記

(1)

imm434imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入裂解循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的λ-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。

二、噬菌體載體選擇標記

(2)

lacZLacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍色透明斑。

二、噬菌體載體選擇標記

(3)

cI基因

cI基因的表達促進λ噬菌體進入溶原狀態(tài)，cI基因產(chǎn)物活性受到影響會促進λ噬菌體進入裂解循環(huán)。hfl（highfrequencyoflysogenization）高頻溶原突變突變的大腸桿菌。

二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內切酶的單一切割位點

篩選標記基因：β-半乳糖苷酶基因、cI基因二、噬菌體載體（1）插入型載體

載體長度37kb插入位點體外包裝插入片段大?。?-14kb（51–37）插入片段體外包裝二、噬菌體載體λgt10載體

cI基因內有一個EcoRI位點二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（2）替換型載體

在其中央部位有一個可以被外源DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。如：

λEMBL3生命科學學院二、噬菌體載體二、噬菌體載體Spi篩選

野生型λ噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coil的生長會受到限制的表型，稱作Spi+，即對P2噬菌體的干擾敏感。這種生長抑制作用是受λ噬菌體red和gam這兩個基因編碼的產(chǎn)物控制的。如果λ噬菌體缺少兩個參與重組的基因red和gam，同時帶有chi位點，并且宿主菌為rec+，則可以在P2溶原性E.coil中生長良好，λ噬菌體的這種表型稱作Spi-。因此，通過λ噬菌體載體DNA上的red和gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶原性細菌鑒別重組和非重組λ噬菌體。二、噬菌體載體插入型載體替換型載體redgam二、噬菌體載體(五)常用的λ噬菌體載體

（一）

β－半乳糖苷失活插入型載體（二）

免疫功能失活插入型載體（三）

Charon系列取代型載體（四）λEMBL系列取代型載體（五）Spi-正選擇取代型載體（六）

λZAP插入型載體

二、噬菌體載體(六)Lambda噬菌體載體的克隆原理及步驟

二、噬菌體載體(七)λ-DNA重組分子的體外包裝

λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后將重組DNA通過噬菌體導入E.coli細胞內。

這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的。二、噬菌體載體D基因缺失的λ噬菌體突變株（D-）E基因缺失的λ噬菌體突變株（E-）EproteinDprotein重組λDNA（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E-的溶原菌BHB2690-D-的溶原菌λ噬菌體的體外包裝系統(tǒng)二、噬菌體載體λ-DNA作為載體的優(yōu)點

λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡便λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因

二、噬菌體載體M13、f1、fd都為絲狀單鏈DNA噬菌體。優(yōu)越性：單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復制形式的

DNA簡稱RFDNA；2.不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題；4.容易測定外源DNA片斷的插入取向；5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。二、噬菌體載體

M13噬菌體載體

M13噬菌體是一種含單鏈（+）環(huán)狀DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。用作載體時利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。

這類載體主要用來獲得大量的單鏈DNA片段，主要用來測定DNA序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。二、噬菌體載體

M13噬菌體的特點

感染Ecoli后，在宿主細胞內會形成雙鏈的復制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）?？梢韵筚|粒DNA那樣在體外進行純化和操作。

絲狀噬菌體顆粒的大小是根據(jù)其DNA的大小決定的，這一點正好與λ噬菌體相反，所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。

二、噬菌體載體M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機制

1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（－）鏈，該雙鏈稱復制型DNA（RFDNA）。

2、RFDNA在宿主細胞內能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。

3、單鏈特異的DNA結合蛋白結合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即（－）鏈的合成，這樣，細胞就會不斷的合成（+）鏈DNA。

4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質復合物，然后轉移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋白質從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。

二、噬菌體載體二、噬菌體載體二、噬菌體載體二、噬菌體載體二、噬菌體載體插入一段lacDNA片段，即帶有

-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列及其N端頭146個aa編碼信息，宿主F’因子攜帶缺失第11-41位氨基酸的lacZ’M13mp載體系列二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎構建的載體:裝載量大，能排斥空載體，轉染效率高,操作較難，

DNA不穩(wěn)定。單純以質粒為基礎構建的載體:有天然的抗性選擇標記，操作容易（易于分離和轉化），較穩(wěn)定,裝載量小，轉化效率較低；三、噬菌體-質粒雜合載體(一)黏粒(cosmid)載體

也稱柯斯質粒載體、粘粒。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。三、噬菌體-質粒雜合載體黏粒載體的基本特點

具有λ噬菌體的特性(體外包裝，高效感染等)；具有質粒載體的特性(易于克隆操作、選擇及高拷貝等)；具有較高容量（45kb）的克隆能力；具有與同源性序列的質粒進行重組的能力。

不能體內包裝，不裂解受體細胞，在細胞內不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑。三、噬菌體-質粒雜合載體三、噬菌體-質粒雜合載體應用黏粒作載體進行基因克隆的一般程序三、噬菌體-質粒雜合載體黏粒載體的克隆原理及步驟

1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同

3．體外包裝：在

的A蛋白的功能作用下切割cos位點并將其中的DNA包裝到成熟的

噬菌體顆粒中去

4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細胞并通過cos位點的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質粒一樣復制三、噬菌體-質粒雜合載體常用黏粒載體結構圖

79三、噬菌體-質粒雜合載體缺點：A、多個Cosmid分子自連，降低陽性率；B、多個DNA分子同時插入，失真。三、噬菌體-質粒雜合載體(二)噬菌粒載體

由質粒載體和單鏈噬菌體載體結合而成的新型的載體系列。

它具有質粒的復制起點、選擇性標記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內穩(wěn)定存在；又具有單鏈噬菌體的復制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。

三、噬菌體-質粒雜合載體常用的噬菌粒載體pUC118和pUC119

1.具有較小分子量的共價、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進行分離與操作；

2.編碼一個ampr基因作為選擇記號，便于轉化子的選擇；

3.拷貝數(shù)含量高，每個寄主可高達500個；

4.存在著一個多克隆位點區(qū)；

5.可進行藍白斑篩選；三、噬菌體-質粒雜合載體6.插入的外源基因以融合蛋白質的形式表達；7.含有質粒的復制起點，克隆的外源基因可以像質粒一樣按常規(guī)的方式，復制形成大量的雙鏈DNA分子；8.帶有一個M13噬菌體的復制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.在pUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當中的一個可轉錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉錄出負鏈DNA；10.可以直接對克隆的DNA片斷進行核苷酸的序列測定，免去了從質粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。三、噬菌體-質粒雜合載體三、噬菌體-質粒雜合載體pBluescript噬菌粒載體

基本結構：

1.在多克隆位點的兩側，有一對T3和T7噬菌體的啟動子，可以定向指導外源基因的轉錄活動；

2.同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質粒的復制起點，在不同的情況下，可以采取不同的復制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；

3.編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，供作轉化子記號；

4.含有l(wèi)acZ基因，可用Xgal-IPTG組織顯色反應法篩選噬菌粒載體。三、噬菌體-質粒雜合載體用于體外轉錄pBluescript噬菌粒載體T7T3四、人工染色體及其應用

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，

此時柯斯質粒(45kb)和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。

將細菌接合因子或酵母染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，

它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。

四、人工染色體及其應用

人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復制元件來驅動外源DNA片段復制的載體。

實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質?？寺≥d體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質粒復制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

四、人工染色體及其應用

(一)酵母人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。

YAC具有自主復制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因?？梢越邮?50-400kb的外源DNA片段。

四膜蟲的端粒序列

酵母染色體的復制子

酵母染色體的著絲粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標記

大腸桿菌的復制子

大腸桿菌的選擇標記四、人工染色體及其應用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用四、人工染色體及其應用

用pYAC3進行克隆策略如下：

載體用BamHI和SnaBI雙酶切，形成3個片段。

移去BamHI之間的片段，留下另外兩段，每一段的兩端都分別是TEL序列和SnaBI位點。

被克隆的DNA，兩端必須切成平末端(SnaBI是一個平末端內切酶，識別TACGTA序列)。

把三者連接起來，形成了人工染色體。

用原生質轉化的方法把人工染色體轉入釀酒酵母。用作宿主的菌株是雙營養(yǎng)缺陷型Trp1-ura3-

，可以被人工染色體上的篩選標記基因恢復成Trp1+ura3+

。

在基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，只有含有結構正確的人工染色體的轉化體可以生存。

如果染色體構建錯誤，如在被克隆的DNA兩側連接了相同的兩段載體DNA片段，則因缺少一種篩選標記，使得轉化體不能在基本成分培養(yǎng)基上存活。

外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判斷，即可以很簡單地由菌落的顏色看出：紅色的菌落是重組體，而白色的菌落則不是。四、人工染色體及其應用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用pYAC3四、人工染色體及其應用(二)細菌人工染色體

細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC)通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。

pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結構

構建動植物基因文庫

缺點：會出現(xiàn)插入片段在結構上的不穩(wěn)定，導致克隆DNA部分的缺失或重排。四、人工染色體及其應用(三)P1噬菌體人工染色體

結合了

P1載體和

BAC載體的最佳特性，包括陽性選擇標記

sacB及噬菌體

P1的質粒復制子和裂解性復制子。

sacB：蔗糖果聚糖酶

第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復制子即可；表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達。第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體表達載體構建的一般原則

1.閱讀框架與外源基因高效表達

2.啟動子與外源基因高效表達

3.轉錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達

4.有效的翻譯起始與外源基因高效表達

5.終止密碼子選擇與外源基因高效表達

6.外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達第二節(jié)

表達載體真核基因在原核細胞中表達，載體必須具備的條件：⑴載體能夠獨立復制，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD(Shine-Dalgarnosequence)序列，以便轉錄后順利翻譯。第二節(jié)

表達載體大腸桿菌表達載體的基本成分第二節(jié)

表達載體啟動子：影響表達效率的主要因素之一是啟動子的強弱。常見啟動子見下表。啟動子的強弱取決于啟動子本身的序列，尤其是—10和—35區(qū)的堿基組成及彼此的間隔長度，同時也與啟動子和外源基因轉錄起始位點間的距離有很大關系。第二節(jié)

表達載體啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACT

PtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT啟動子第二節(jié)

表達載體

最佳啟動子具備的條件：

第一必須是強啟動子第二啟動子應是誘導型的（熱或化學誘導）第二節(jié)

表達載體強化轉錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，過長轉錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達。終止子

強終止子的選擇與使用

目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。第二節(jié)

表達載體

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）核糖體結合位點第二節(jié)

表達載體大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個部分：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子

大腸桿菌絕大部分基因以

AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結合位點第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。構建Ecoli.表達載體時要考慮所表達基因的種類和性質，或對外源基因的堿基進行適當置換，或對克隆載體上的調控序列進行適當調整。第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體第二節(jié)

表達載體一、質粒表達載體(一)原核表達載體

適用于在原核細