第7章 微生物遺傳與菌種選育(新)

遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)基因突變和誘變育種基因重組和雜交育種（自學(xué)）基因工程菌種的衰退復(fù)壯和保藏內(nèi)容提要

第七章微生物的遺傳變異和育種遺傳（heredity

inheritance）：親代與子代相似變異（variation）：親代與子代、子代間不同個(gè)體不完全相同遺傳（inheritance）和變異（variation）是生命的最本質(zhì)特性之一（1）遺傳型（genotype）生物的全部遺傳因子及基因又稱基因型，指某一生物個(gè)體所含有的全部遺傳因子即基因組（genome）所攜帶的遺傳信息。遺傳型是一種內(nèi)在可能性或潛力，其實(shí)質(zhì)是遺傳物質(zhì)上所負(fù)載的特定遺傳信息（2）表型（phenotype）具有一定遺傳型的個(gè)體，在特定環(huán)境條件下通過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育所表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。又稱表現(xiàn)型，指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是其遺傳型在合適環(huán)境下通過(guò)代謝和發(fā)育而得到的具體表現(xiàn)。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。（3）變異遺傳型變異（基因變異、基因突變）：指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，亦即遺傳型的改變。遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點(diǎn)：遺傳性、群體中極少數(shù)個(gè)體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-5-10-10）表型飾變：指不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯水平上的表型變化。表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點(diǎn)：暫時(shí)性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。（4）飾變（modification）表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)暫時(shí)性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個(gè)體的行為例如：粘質(zhì)沙雷氏菌：25℃下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；37℃下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；重新將溫度降25℃，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。斜面培養(yǎng)液體培養(yǎng)微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系

很多常見(jiàn)微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長(zhǎng)繁殖。

對(duì)環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883－－1889年間Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。FCrick在研究DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)基因?qū)W說(shuō)：1933年摩爾根（ThomasHuntMorgan）發(fā)現(xiàn)了染色體，并證明基因在染色體上呈直線排列，提出了基因?qū)W說(shuō)，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，先后有利用微生物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行的三個(gè)著名實(shí)驗(yàn)肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)噬菌體感染試驗(yàn)病毒的拆開(kāi)與重建試驗(yàn)人們普遍接受核酸才是真正的遺傳物質(zhì)。一、3個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)

（一）經(jīng)典轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

最早進(jìn)行轉(zhuǎn)化（transformation）實(shí)驗(yàn)的是F.Griffith（1928年），他以Streptococcuspneumoniae（肺炎鏈球菌，舊稱“肺炎雙球菌”）作為研究對(duì)象。光滑型（S）粗糙型（R）有莢膜菌落光滑分泌毒素致病無(wú)莢膜菌落粗糙無(wú)毒不致病實(shí)驗(yàn)材料：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：加熱殺死的S型細(xì)菌中有一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它通過(guò)某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞，并使R型細(xì)菌獲得表達(dá)S型莢膜形狀的遺傳特性1928年Griffith進(jìn)行的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（2）細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)（3）S型菌的無(wú)細(xì)胞抽提液試驗(yàn)Avery在四十年代以更精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)重復(fù)了以上實(shí)驗(yàn)（1）從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA，蛋白質(zhì)，莢膜多糖等）（2）對(duì)各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說(shuō)明：S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的DNA是遺傳因子。

1952年，A.D.Hershey和M.Chase發(fā)表了證明DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的著名實(shí)驗(yàn)

——噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（p188）蛋白質(zhì)只含S不含PDNA只含P不含S原理步驟1：用含同位素Ｓ35,

P32的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)大腸桿菌2：讓T2感染上述大腸桿菌使其打上S35

、P32標(biāo)記35S－蛋白質(zhì)外殼的噬菌體32P－DNA核心的噬菌體在DNA中存在著包括合成蛋白質(zhì)外殼在內(nèi)的整套遺傳信息。（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含15%放射性沉淀中含85%放射性沉淀中含25%放射性以35S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn)（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中10分鐘后用搗碎器使空殼脫離吸附離心沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體上清液中含75%放射性

為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)（p189）

植物病毒蛋白質(zhì)和RNA可以人為地分開(kāi),同時(shí)又可把它們重新組合成具感染性的病毒.植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

甲ＲＮＡ＋乙Ｐr→感染癥狀同甲病毒；分離得到甲病毒乙ＲＮＡ＋甲Ｐr→感染癥狀同乙病毒；分離得到乙病毒

TMVHRVHRVTMV原始株拆開(kāi)重建感染分離純化

植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)

遺傳物質(zhì)類型核染色體核外染色體真核生物細(xì)胞器原核生物質(zhì)粒二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式核外DNA的種類核外染色體真核生物的“質(zhì)?！痹松锏馁|(zhì)粒

線粒體細(xì)胞質(zhì)基因 葉綠體 中心體 動(dòng)體共生生物：卡巴顆粒酵母菌的2

m質(zhì)粒F因子R因子Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒（一）核酸存在的7個(gè)水平細(xì)胞水平：存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體，單核或多核細(xì)胞核水平:

原核與真核生物的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不同，核外DNA染色體水平:

倍性(真核)和染色體數(shù)核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈基因水平：具自主復(fù)制能力的遺傳功能單位，長(zhǎng)度與信息量，轉(zhuǎn)錄——翻譯密碼子水平：信息單位,起始和終止,核苷酸水平：突變或交換單位，四種堿基（二)原核生物的質(zhì)粒（p194）功能：帶有一些基因，如產(chǎn)生毒素、抗藥性、固氮、產(chǎn)生酶類、降解功能等，并可進(jìn)行細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。結(jié)構(gòu)與大?。嘿|(zhì)粒通常以共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子狀態(tài)存在于細(xì)胞中。約為1～1000kb，上面攜帶有數(shù)個(gè)到數(shù)十個(gè)甚至上百個(gè)基因。定義：存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中，獨(dú)立于染色體外，能進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳因子。質(zhì)粒核外環(huán)狀小型DNA獨(dú)立復(fù)制穩(wěn)定遺傳F因子與有性接合有關(guān)種類

R因子與抗藥性有關(guān)COL編碼免疫蛋白Ti質(zhì)粒誘癌質(zhì)粒降解性質(zhì)粒：編碼降解有害物質(zhì)的酶用途基因工程中作為目的基因載體質(zhì)粒原核生物遺傳物質(zhì)存在的另一種方式基因突變突變與育種第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變（genemutation）一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變簡(jiǎn)稱突變，是變異的一種，泛指細(xì)胞內(nèi)（或病毒粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。突變幾率一般很低（10-6～10-9）從自然界分離到的菌株，簡(jiǎn)稱野生型。

野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，又稱突變體或突變型。突變株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）（一）突變類型凡能用選擇性培養(yǎng)基（或其他選擇性培養(yǎng)條件）快速選擇出來(lái)的突變株。選擇性突變株（selectivemutant）非選擇性突變株（non-selectivemutant）反之。突變株的表型非選擇性突變株選擇性突變株抗性突變型（株）營(yíng)養(yǎng)缺陷型（株）條件致死突變型（株）形態(tài)突變型（株）抗原突變型（株）產(chǎn)量突變型（株）1.

營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸的能力，只有從周圍環(huán)境或培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)或其前體物（precursor）才能正常生長(zhǎng)繁殖的變異類型，稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——十分重要表型判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在基本培養(yǎng)基上能否生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisChisC－缺陷型hisC＋野生型2.

抗性突變型（resistantmutant）

指野生型菌株因發(fā)生基因突變，使菌株對(duì)對(duì)某化學(xué)藥物或致死物理因子，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性的抗性變異類型。特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得——在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)。所以很容易分離得到。）表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”表示。strr對(duì)鏈霉素的抗性strs對(duì)鏈霉素的敏感性抗性突變菌株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中——極為重要3.

條件致死突變型（conditionallethalmutant）

某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在某種條件下可正常地生長(zhǎng)、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型。在25℃下可感染其E.coli宿主在37℃卻不能感染Ts突變株即溫度敏感突變株（temperaturesensitivemutant，Tsmutant）是一類典型的條件致死突變株。E.coli的某些菌株在37℃下正常生長(zhǎng)不能在42℃下生長(zhǎng)某些T4噬菌體突變株產(chǎn)生Ts突變的原因在某特定的溫度下具有功能在另一溫度（一般為較高溫度）下則無(wú)功能突變使某些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，4.

形態(tài)突變型（morphologicalmutant）指由于突變而引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的非選擇性變異。個(gè)體變異孢子有無(wú)、孢子顏色、鞭毛有無(wú)或莢膜有無(wú)等的突變菌落變異菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突變特點(diǎn)：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長(zhǎng)，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。舉例：菌落顏色變化β半乳糖苷酶基因的插入失活重組子菌落白色非重組子菌落蘭色5.

抗原突變型（antigenicmutant）指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，一般也屬非選擇性突變。例如，細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。6.

產(chǎn)量突變型（metabolitequantitativemutant）通過(guò)基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株，稱為產(chǎn)量突變型?！罢冎辍保╬lus-mutant）產(chǎn)量高于原始菌株“負(fù)變株”（minus-mutant）產(chǎn)量低于原始菌株篩選高產(chǎn)正變株的工作對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐極其重要在育種實(shí)踐上誘變育種重組育種遺傳工程育種突變率每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率例如，突變率為10-8的，指該細(xì)胞在1億次細(xì)胞分裂中，會(huì)發(fā)生1次突變。某一單位群體在每一世代（即分裂1次）中產(chǎn)生突變株（mutant，即突變型）的數(shù)目來(lái)表示例如，一個(gè)含108個(gè)細(xì)胞的群體，當(dāng)其分裂為2×108個(gè)細(xì)胞時(shí)，即可平均發(fā)生一次突變的突變率也是10-8。（二）突變率（mutationrate）基因突變的7個(gè)共同點(diǎn)（1）自發(fā)性各種性狀的突變，可在無(wú)人為的誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。（三)基因突變的特點(diǎn)（p200）（2）非對(duì)應(yīng)性突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這是突變的一個(gè)重要特點(diǎn)，也是容易引起爭(zhēng)論的問(wèn)題（3）稀有性自發(fā)突變雖可隨時(shí)發(fā)生，但其突變率卻是極低和穩(wěn)定的，一般在10-6～10-9間。某基因的突變率不受它種基因突變率的影響。（5）可誘變性自發(fā)突變的頻率可因誘變劑（mutagen）的影響而大為提高（10～105倍）。（4）獨(dú)立性基因突變后的新遺傳性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。野生型菌株某一性狀可發(fā)生正向突變（forwardmutation），也可發(fā)生相反的回復(fù)突變（reversemutation或backmutation

，也稱回變）。（7）可逆性（6）穩(wěn)定性

誘發(fā)突變簡(jiǎn)稱誘變，是指通過(guò)人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段1.誘發(fā)突變（inducedmutation）凡具有誘變效應(yīng)的任何因素，都稱誘變劑（mutagen）。（五）基因突變及機(jī)制

p202誘變機(jī)制移碼突變?nèi)旧w畸變

堿基的置換

（1）堿基的置換直接引起置換的誘變劑HNO2CNH2腺嘌呤CO次黃嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黃嘌呤(He)間接引起置換的誘變劑堿基的置換COHT：烯醇式CT：酮式OA..TT..

AG..

CA..T酮式T..

G烯醇式（2）移碼突變ＤＮＡ分子中缺失或增加少數(shù)幾個(gè)堿基對(duì)而引起造成突變點(diǎn)以后全部遺傳密碼轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)釋發(fā)生錯(cuò)誤ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一個(gè)堿基缺少一個(gè)堿基（3)染色體畸變

某些理化因子，如Ｘ射線，紫外線，亞硝酸等，除能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA分子大損傷，包括染色體易位，倒位，缺失，重復(fù)等，即為染色體畸變。2.自發(fā)突變（spontaneousmutation）(p206)

自發(fā)突變（spontaneousmutation）是指生物體在無(wú)人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。自發(fā)突變的原因（1）背景輻射和環(huán)境因素（3）DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物一個(gè)1000bp的基因自發(fā)突變頻率約為10-6例如，過(guò)氧化氫等例如，天然的宇宙射線等（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外線（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚體（TT，TC，CC）和水合物二、突變與育種（p208）（一）自發(fā)突變與育種1.從生產(chǎn)中選育2.定向培育優(yōu)良品種（二）誘變育種從青霉素產(chǎn)量看誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種的原則（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）

誘變育種

是指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供科學(xué)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的

效價(jià)：指有效成分的濃度。1ug/ul稱為1單位1945時(shí)間1943194319431947195519711977目前發(fā)酵單位(u/ml)100250500～850～850～8000～2萬(wàn)～5萬(wàn)5～10萬(wàn)從青霉素產(chǎn)量看誘變育種可獲得供工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡(jiǎn)化工藝等。誘變育種具有重大的實(shí)踐意義1.誘變育種的基本環(huán)節(jié)（p209）大多死亡少數(shù)存活存活率多數(shù)未變少數(shù)突變突變率多數(shù)負(fù)變少數(shù)正變正變率多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大高產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)出發(fā)菌株計(jì)算出誘變出發(fā)菌株純化、同步培養(yǎng)培養(yǎng)液離心收集細(xì)胞，洗滌，制菌懸液玻璃珠打散，過(guò)濾細(xì)胞或孢子懸液誘變處理平板分離初篩復(fù)篩保藏及擴(kuò)大試驗(yàn)活菌計(jì)數(shù)，誘變預(yù)備試驗(yàn)存活細(xì)胞計(jì)數(shù)，致死率計(jì)算變異率計(jì)算2.誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個(gè)原則選優(yōu)良的出發(fā)菌株選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液選用最適劑量設(shè)計(jì)或采用高效篩選方案或方法利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)（1）選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑出發(fā)菌株含誘變劑的液體培養(yǎng)基接種培養(yǎng)培養(yǎng)接種分離紫外線選擇優(yōu)良突變株S.t.his回變S.t.his吸入濾紙片保溫可疑“三致”試樣鼠肝勻漿（含羥化酶）陽(yáng)性陰性利用回變檢測(cè)致癌劑

——艾姆斯試驗(yàn)法（p210）

平板上無(wú)大量菌落出現(xiàn)，說(shuō)明樣品不含誘變劑；有抑制圈出現(xiàn)，并在外圍長(zhǎng)滿大量菌落，說(shuō)明濃度過(guò)高；在濾紙片周圍長(zhǎng)滿菌落說(shuō)明濃度合適。該法廣泛用于監(jiān)測(cè)食品飲料藥物等試樣中的致癌物時(shí)間3天，準(zhǔn)確率85%。（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（p211）生產(chǎn)中用過(guò)的自發(fā)變異菌株采用具有有利性狀的菌株采用已發(fā)生其他變異的菌株采用前體或最終產(chǎn)物代謝高的菌株采用增變菌株（3）處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢放線菌，霉菌應(yīng)處理孢子細(xì)菌指數(shù)期，放線菌霉菌要稍加萌發(fā)后使用出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸夜（4）選用最適劑量劑量以誘變劑濃度和處理時(shí)間來(lái)表示合適劑量：能擴(kuò)大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)兩種或多種誘變劑先后使用同種誘變劑重復(fù)使用兩種或多種誘變劑同時(shí)使用（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)，生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)淀粉酶變色圈試驗(yàn)變色圈大的為淀粉酶高產(chǎn)菌落在瓊脂平板上，通過(guò)觀察測(cè)定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機(jī)取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長(zhǎng)圈的大?。y(cè)定生長(zhǎng)因子產(chǎn)生），纖維素酶對(duì)纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計(jì)某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標(biāo)。（7）設(shè)計(jì)或采用高效篩選方案或方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、高效的科學(xué)篩選方案。初篩篩選工作復(fù)篩以量為主（選留較多有生產(chǎn)潛力的菌株）以質(zhì)為主（對(duì)少量潛力大的菌株的代謝產(chǎn)物量作精確測(cè)定）一個(gè)出發(fā)菌株誘變劑處理選出200個(gè)單孢子菌菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株第一輪第二輪五個(gè)出發(fā)菌株初篩（每株1瓶）選出50株復(fù)篩（每株4瓶）選出5株40株40株40株40株40株誘變劑處理初篩復(fù)篩對(duì)產(chǎn)量突變株生產(chǎn)性能的測(cè)定方法粗測(cè)為主在培養(yǎng)皿平板上在搖瓶中（8）創(chuàng)造新型篩選方法較精確的測(cè)定搖瓶培養(yǎng)or臺(tái)式自控發(fā)酵罐培養(yǎng)3.突變株的篩選方法

(p212）

高產(chǎn)突變菌株的篩選方法抗性突變體的篩選方法營(yíng)養(yǎng)缺陷型的的篩選方法與突變株的篩選相關(guān)的幾個(gè)概念（1）產(chǎn)量突變株的篩選

1971年，國(guó)外有人報(bào)道了篩選春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生產(chǎn)菌時(shí)所采用的一種瓊脂塊培養(yǎng)法，一年內(nèi)曾使該抗生素產(chǎn)量提高10倍。此法的關(guān)鍵是用打孔器取出含有一個(gè)小菌落的瓊脂塊作分別培養(yǎng)。這樣，各瓊脂塊所含養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，且產(chǎn)生的抗生素等代謝產(chǎn)物不致擴(kuò)散出瓊脂塊外。數(shù)據(jù)精確，效率高（2）抗藥性突變株的篩選基因突變使菌株對(duì)某種或某幾種藥物，特別是抗生素，產(chǎn)生抗性。特點(diǎn)：正選擇標(biāo)記（突變株可直接從抗性平板上獲得-----在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)。所以很容易分離得到。）

梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過(guò)制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板、在其上涂布誘變處理后的細(xì)胞懸液、經(jīng)培養(yǎng)后再?gòu)钠渖线x取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應(yīng)抗藥性突變株。梯度平板法（gradientplate）是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法。表示方法：所抗藥物的前三個(gè)小寫斜體英文字母加上“r”。strrstrs對(duì)鏈霉素的抗性敏感性（3）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（auxotrophicmutant）在生物學(xué)基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究以及生產(chǎn)實(shí)踐上都有極其重要的意義。營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表示方法：基因型：所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫斜體字母表示：hisC（組氨酸缺陷型，其中的大寫字母C同一表型中不同基因的突變）表型：同上，但第一個(gè)字母大寫，且不用斜體：HisC在具體使用時(shí)多用hisC-和hisC+，分別表示缺陷型和野生型。a.基本培養(yǎng)基（MM，符號(hào)為［－］）①與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的3類培養(yǎng)基

僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需的最低成分的組合培養(yǎng)基，稱MM。b.完全培養(yǎng)基（completemedium，CM，符號(hào)為［＋］）

凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基，稱為CM。一般可在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素、核苷酸和堿基之類的天然物質(zhì)，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。c.補(bǔ)充培養(yǎng)基（supplementalmedium，SM，符號(hào)為［A］或［B］等）

凡只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株生長(zhǎng)需要的組合或半組合培養(yǎng)基，稱為SM。在基本培養(yǎng)基上再添加對(duì)某一營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株所不能合成的某相應(yīng)代謝產(chǎn)物所組成，可專門選擇相應(yīng)的突變株。原養(yǎng)型（prototroph）②與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的3類遺傳型個(gè)體野生型（wildtype，wildstrain）營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）從自然界分離到的原始菌株（A＋B＋）經(jīng)誘變劑處理后的突變株（A—B—）經(jīng)回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株（A＋B＋）營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選辦法

(p215)1.誘變劑處理2.淘汰野生型3.檢出缺陷型夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法4.鑒定缺陷型基本培養(yǎng)基（MM）[-]：凡是能滿足野生型菌株?duì)I養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基（CM）[+]：滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的天然或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM）[x]：在MM中有針對(duì)性地加入一或幾種營(yíng)養(yǎng)成分以滿足相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基。與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株相關(guān)的3類培養(yǎng)基三類遺傳型野生型[A+B+]營(yíng)養(yǎng)缺陷型型[A+B-]原養(yǎng)型[A+B+]與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變相關(guān)的3類遺傳型個(gè)體

（p215）夾層培養(yǎng)法（p216）夾層培養(yǎng)法及結(jié)果小菌落是第二次長(zhǎng)起來(lái)的（營(yíng)養(yǎng)缺陷型）限量補(bǔ)充培養(yǎng)法微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上