黃芩制劑抗病毒和保護(hù)細(xì)胞作用機(jī)制研究

黃芩制劑抗病毒和保護(hù)細(xì)胞作用機(jī)制研究

黃鼠狼是一種常見(jiàn)的清熱解毒藥物。它具有凈化火焰、消除濕熱、止血、安胎的作用。其主要成分是黃酮類化合物。現(xiàn)代藥理研究表明,黃芩中黃芩苷、黃芩苷元等有效成分具有抗微生物、抗炎抗變態(tài)反應(yīng)、解熱等作用。研究發(fā)現(xiàn),黃芩煎劑體外對(duì)流感病毒PR8株有抑制作用,小鼠感染病毒后,能減輕肺部損傷和延長(zhǎng)存活時(shí)間。臨床上應(yīng)用以黃芩為臣藥的復(fù)方中藥制劑治療柯薩奇病毒B3m所致的病毒性心肌炎,無(wú)論在臨床癥狀、體征恢復(fù)上,還是在心電圖的改善上均有明顯療效。在本次研究中采用了兩種不同的提取方法:一種是保留盡可能多的黃芩苷為主的精提法,一種是盡可能多的保存黃酮類化合物成分的粗提法。對(duì)兩種黃芩制劑進(jìn)行比較,以抑制病毒指數(shù)為指標(biāo)檢測(cè)兩者滅活病毒能力,應(yīng)用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)兩種檢測(cè)方法比較其保護(hù)細(xì)胞的不同效果,從而探討黃芩提取物抗病毒和保護(hù)細(xì)胞作用的機(jī)制,為中藥有效成分作用機(jī)制研究提供依據(jù)。目前認(rèn)為病毒的直接作用及其引發(fā)的心肌組織的自身免疫損傷是病毒性心肌炎(VMC)的主要病理機(jī)制。流行病學(xué)研究表明,柯薩奇B組病毒是人類病毒性心肌炎(VMC)的主要病原。迄今為止,國(guó)內(nèi)外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界仍然以營(yíng)養(yǎng)心肌等支持療法作為VMC的主要治療方法,因而探討有效的抗病毒及保護(hù)心肌細(xì)胞的藥物勢(shì)在必行,這也是中醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)MC防治研究的一大熱點(diǎn)。1材料和試劑1.1中毒的場(chǎng)所CVB3m(Nancy株,上海中山醫(yī)院病毒性心肌炎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊英珍教授惠贈(zèng))。測(cè)TCID50為3.65×10-4。1.2ps和mem黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);DMEM(美國(guó)Gibco公司);青霉素、鏈霉素(PS)(沈陽(yáng)第六制藥廠);MTT(華美試劑公司,用培養(yǎng)液配制成5g·L-1的溶液)。1.3培養(yǎng)箱和顯微鏡LC-6A高效液相色譜儀(日本島津公司),紫外檢測(cè)器,大連中北色譜工作站。4950ECO2培養(yǎng)箱(Nuaire公司);Benchmark酶標(biāo)儀(Bio-RAD公司);倒置顯微鏡(LECIA公司);CMIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)(北京中山公司);超低溫冰箱MDF382E(SONY公司);生物安全柜(Nuaire公司);微量細(xì)胞培養(yǎng)板(COSTAR公司)。1.4色譜柱及流動(dòng)相Shim-packCLC-ODS(4.6mm×200mm,5μm)色譜柱;檢測(cè)波長(zhǎng):278nm;流動(dòng)相:甲醇-0.025mol·L-1(45∶55);流速1.0mL·min-1。2方法2.1中藥風(fēng)味處理2.1.1含生藥的制備由遼寧中醫(yī)學(xué)院臨床藥理基地實(shí)驗(yàn)室制備,具體流程:黃芩飲片5kg加入8倍體積的70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))中,置高能提取罐內(nèi)回流提取2次,每次1.5h,濾過(guò),合并濾液。取剩余藥物殘?jiān)?加入8倍量水常壓提取2次,每次1h,濾過(guò),合并濾液。將每組藥物的醇提取液和水提取液分別置單放濃縮缸內(nèi)減壓濃縮,然后分別將醇提和水提的濃縮液混勻,置高速離心噴霧干燥機(jī)中進(jìn)行噴霧干燥,收集干燥粉,保存?zhèn)溆?。將粗提物分別用蒸餾水配制成體外實(shí)驗(yàn)用溶液,均為含生藥100g·L-1。將溶液離心取上清液,濾膜過(guò)濾,高壓滅菌備用。2.1.2ph值的提取黃芩粗粉加8倍沸水中每次煮1h,煮3次,濾過(guò),合并濾液;將藥液加入濃鹽酸中調(diào)pH值為2,酸液加熱80℃,保溫靜置30min。將沉淀用熱水洗2~3次,抽干;沉淀中加10倍水,混勻,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%氫氧化鈉調(diào)pH值為6~7,加入樣品量質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的活性碳,50℃保溫30min,濾過(guò);將濾液加等體積體積分?jǐn)?shù)95%乙醇,用濃鹽酸調(diào)pH值為2,濾過(guò);將沉淀用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇4倍洗,體積分?jǐn)?shù)95%乙醇4倍洗,烘干,得到黃芩精提物。精密稱取黃芩精提物500mg,放入量瓶中,加蒸餾水至100mL,水浴超聲30min,高溫滅菌,調(diào)pH值為7.2,離心取上清備用。其質(zhì)量濃度為10g·L-1。2.2對(duì)照溶液的制備精密稱取干燥恒重的黃芩苷對(duì)照品適量,配成1mL含0.1586mg的對(duì)照品溶液。2.3測(cè)量法精密吸取對(duì)照品溶液10μL,供試品溶液5μL,注入高效液相色譜儀,測(cè)定峰面積,計(jì)算含量。2.4細(xì)胞生長(zhǎng)觀察用培養(yǎng)液將兩組藥物分別按1∶2倍比稀釋,加入已制備好的單層Hela細(xì)胞上,每孔200μL,每一稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。正常細(xì)胞組以培養(yǎng)液代替藥液,培養(yǎng)3d,逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。計(jì)算藥物最大無(wú)毒濃度(TD0)。2.5病毒滴度法和抑制病毒指數(shù)測(cè)定將各組藥液分別與200TCID50的CVB3m病毒液等量混合,最終濃度分別為T(mén)D0,1/2TD0和1/4TD0,然后置37℃作用2h;同時(shí)病毒對(duì)照組以培養(yǎng)液代替藥液與200TCID50的病毒等量混合后置37℃作用2h,而后用微量細(xì)胞板分別測(cè)定藥物組和病毒組的病毒滴度,以最后1dCPE達(dá)“++”(50%細(xì)胞出現(xiàn)病變)以上病變?yōu)殛?yáng)性孔,無(wú)病變或病變?cè)?0%或以下作為陰性孔,按Reed-Muench法測(cè)定病毒的TCID50。然后計(jì)算各組藥物的抑制病毒指數(shù)。抑制病毒指數(shù)=︱病毒對(duì)照組logTCID50-藥物組logTCID50︱。2.6細(xì)胞活性檢測(cè)藥物分組:兩種藥物分3個(gè)濃度TD0,1/2TD0,1/4TD0,每種濃度分①預(yù)防性保護(hù)組:每孔以含藥物維持液于感染前培養(yǎng)24h,24h后吸出藥液,用Hank’s液洗3次,每孔加入100TCID50CVB3m100μL吸附1h后,加維持液培養(yǎng)。②感染后保護(hù)組:在單層細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100TCID50CVB3m100μL吸附1h,用Hank’s液洗去病毒,加含藥維持液培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組。檢測(cè)指標(biāo):觀察CPE和MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。①觀察CPE:每組自接種病毒24h后,逐日在倒置顯微鏡下觀察CPE。25%CPE為“+”;50%CPE為“++”;75%CPE為“+++”;100%CPE為“++++”。②MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性:接種病毒72h后,吸棄培養(yǎng)上清液,用37℃pH7.6的PBS洗滌1次,每孔加180μL培養(yǎng)液,再加入20μLMTT溶液,37℃孵育4h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液100μL,加入等量含0.04mmol·L-1鹽酸異丙醇溶液,振蕩5min,使結(jié)晶物充分溶解,選擇490nm波長(zhǎng)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(A),記錄結(jié)果。計(jì)算藥物保護(hù)率=(感染給藥組A-病毒對(duì)照組A)/(正常細(xì)胞對(duì)照組A-病毒對(duì)照組A)×100%。2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,3組的計(jì)量資料分析采用單因素的方差分析,兩兩比較采用LSD分析方法。3結(jié)果3.1藥物組對(duì)小鼠cpe情況的影響加入藥物72h后觀察結(jié)果:黃芩粗提物濃度≥3.125g·L-1時(shí),細(xì)胞有不同程度的脹大,變圓,細(xì)胞內(nèi)有粗大顆粒,部分細(xì)胞脫落;黃芩精提物濃度≥2.50g·L-1時(shí),細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)病變;正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好。各藥物組CPE情況采用倒置顯微鏡觀察,見(jiàn)表1。黃芩粗提物對(duì)Hela細(xì)胞的TD0為1.563g·L-1,黃芩精提物的TD0為1.25g·L-1。3.2對(duì)體外直接滅活病毒作用的抑病毒指數(shù)檢測(cè)兩組藥物作用后病毒滴度均有所下降,從抑制指數(shù)來(lái)分析,黃芩粗提物組在TD0濃度時(shí),抑制病毒指數(shù)大于2,表現(xiàn)出明顯的直接滅活病毒作用;而黃芩精提物組在TD0,1/2TD0,1/4TD0濃度的抑病毒指數(shù)均小于2。提示在體外直接滅活病毒作用方面,黃芩精提物作用不明顯。結(jié)果見(jiàn)表2。3.3兩組的預(yù)防保護(hù)率結(jié)果見(jiàn)表3,4和圖1,2。根據(jù)CPE法和MTT法兩種檢測(cè)方法,兩組藥物的預(yù)防保護(hù)率無(wú)顯著性差異(P>0.05);兩組藥物均有明顯的保護(hù)病毒感染細(xì)胞的作用,而黃芩粗提物組在1/2TD0濃度時(shí)治療保護(hù)率明顯高于黃芩精提物組,具有顯著性差異(P<0.05)。3.4復(fù)配中黃芪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測(cè)黃芩粗提物組具有色譜峰數(shù)量多,而黃芩精提物組的色譜峰明顯少于黃芩粗提物組,黃芩粗提物的黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.691%;而黃芩精提物中黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.826%。藥物濃度在TD0時(shí),黃芩粗提物中黃芩苷為0.042g·L-1;而黃芩精提物中黃芩苷為0.048g·L-1。兩組藥物中TD0時(shí)黃芩苷含量相似。4合成cem-hiv在細(xì)胞毒性作用黃芩作為傳統(tǒng)中藥,其生物活性是多方面的。國(guó)內(nèi)在細(xì)胞水平對(duì)黃芩活性部分的生物活性及作用機(jī)制的研究很少。黃芩有效成分在藥理上已經(jīng)證實(shí)的作用有:黃芩苷有抑菌、清熱、降壓、鎮(zhèn)靜、利尿、利膽、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)等活性;黃芩素有抑菌、利尿、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、利膽等活性;漢黃芩素具有抑菌、利尿、解痙等作用。黃芩的抗病毒作用早已被人們發(fā)現(xiàn),從黃芩中提取的異黃芩素-8-甲醚能顯著抑制流感病毒;黃芩苷對(duì)人T細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-Ⅰ)的抑制呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,其作用機(jī)制是抑制HTLV-Ⅰ的反轉(zhuǎn)錄酶;黃芩素是一種強(qiáng)的鼠白血病病毒(MLV)和人免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制劑,2mg·L-1的黃芩素對(duì)MLV和HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制率在90%以上;另外的研究發(fā)現(xiàn),黃芩苷在一定濃度下對(duì)體外培養(yǎng)的T細(xì)胞株CEM無(wú)細(xì)胞毒性,而對(duì)感染HIV病毒的CEM細(xì)胞則發(fā)生明顯的細(xì)胞毒性,引起細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂,對(duì)高容量釋放HIV病毒CEM-HIV細(xì)胞效應(yīng)尤為明顯,推測(cè)黃芩苷的抗HIV作用可能與選擇性地誘導(dǎo)高病毒釋放的細(xì)胞導(dǎo)致CEM-HIV細(xì)胞的凋亡有關(guān)。筆者采用兩種不同的提取方法,一種以保留盡可能多的黃芩苷為主的精提法,另一種則盡可能多的保存黃酮類化合物成分的粗提法。對(duì)兩種不同提取方法制備的黃芩制劑進(jìn)行指紋圖譜分析,結(jié)果表明,黃芩粗提物可標(biāo)出11個(gè)指紋峰,以黃芩苷為參比,色譜峰的相對(duì)面積計(jì)算可知,黃芩粗提物的相對(duì)峰面積均大于黃芩精提物的相對(duì)峰面積,黃芩粗提物的色譜峰較精提物色譜峰多,成分較黃芩精提物復(fù)雜,兩組藥物濃度TD0中所含黃芩苷濃度相似。黃芩粗提物組在TD0濃度時(shí),抑制病毒指數(shù)大于2,表現(xiàn)出明顯的直接滅活病毒作用,而黃芩精提物的抑制病毒指數(shù)均小于2,提示黃芩精提物直接滅活病毒作用不明顯。根據(jù)兩種藥物成分分析可推測(cè),黃芩粗提物制劑中除黃芩精提物主要成分外的其他黃酮類成分在直接滅活病毒方面可能發(fā)揮了重要作用。兩組制劑均有明顯的保護(hù)病毒感染后細(xì)胞作用,說(shuō)明在治療保護(hù)方面,黃芩精提物中主要成分起到了重要作用。黃芩粗提物在1/2TD0時(shí)治療保護(hù)作用優(yōu)于黃芩精提物組,可推測(cè)黃芩粗提物中其他成分也可能發(fā)揮了作用。兩組制劑均有明顯的保護(hù)病毒感染后細(xì)胞作用,雖然黃芩粗提物在1/2TD0時(shí)治療保護(hù)作用優(yōu)于黃芩精提物組,但在TD0和1/4TD0濃度時(shí)二者作用無(wú)顯著差異,無(wú)明顯量效關(guān)系,因此兩種制劑在保護(hù)病毒感染后細(xì)胞作